PCRとRT PCRの違い

主な違い – PCR と RT-PCR

PCR と RT-PCR は、分子生物学における 2 つの重要な技術です。 PCR は 1980 年代に Kary Mullis によって開発されました。特定の遺伝子のコピー数を指数関数的に増加させることができ、その特定の DNA フラグメントの検出を容易にします。 ターク ポリメラーゼは、PCR システムで最も頻繁に使用される酵素です。耐熱性酵素です。 RT-PCR では、逆転写の後に PCR が続きます。酵素である逆転写酵素は、RNA からの相補的 DNA の合成に関与しています。 主な違い PCR と RT-PCR の違いは、PCR がテンプレートとして二本鎖 DNA を使用するのに対し、RT-PCR はテンプレートとして RNA を使用することです。

対象となる主な分野

1. PCR とは
– 定義、プロセス、適用
2. RT PCRとは
– 定義、特徴、応用
3. PCR と RT PCR の違いは何ですか
– 主な違いの比較

重要な用語:PCR、RT-PCR、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応、DNA テンプレート、DNA ポリメラーゼ、変性、アニーリング、プライマー伸長

PCR とは

PCR (ポリメラーゼ連鎖反応 ) は、比較的単純ですが革新的な方法です。 PCR は、酵素である DNA ポリメラーゼの能力を利用して、提供されたテンプレート鎖に相補的な方法で新しい DNA 鎖を合成します。 PCR は、遺伝子の機能解析、遺伝性疾患の診断とモニタリング、DNA クローニング、配列決定、および古代の DNA 増幅のために臨床および研究ラボで使用される不可欠な技術です。 DNA テンプレート、ヌクレオチド、プライマー、および DNA ポリメラーゼは、PCR の 4 つの主要な構成要素です。 DNA テンプレート は通常、増幅される標的配列を持つ二本鎖 DNA です。 ターク DNAポリメラーゼ これは Thermus aquatics から分離されています PCRでよく使われます。 Pfu DNAポリメラーゼ 忠実度の高い別の種類の DNA ポリメラーゼです。両方Taq とPfu ポリメラーゼは耐熱性があります。 DNA ポリメラーゼによって付加されるヌクレオチドは、アデニン (A)、グアニン (G)、シトシン (C)、およびチミン (T) です。 DNA ポリメラーゼは既存の DNA 鎖の 3' 末端に新しいヌクレオチドを付加することしかできないため、DNA 合成の開始にはオリゴヌクレオチド プライマーが必要です。 PCR におけるプライマーの要件により、テンプレート内の特定の領域のみを描写することができます。ターゲット配列は、フォワードプライマーとリバースプライマーに隣接しています。 PCR の最後に、特定の DNA 配列のアンプリコンと呼ばれる新しいコピーが数十億単位で蓄積されます。 PCR のコンポーネントは、失敗を最小限に抑えながら PCR のパフォーマンスを向上させるような方法で最適化する必要があります。

PCR は、異なる温度を切り替えることができるサーマルサイクラーによって行われる自動化されたプロセスです。 PCR は 3 ステップのプロセスです。

3 つのステップを 28 ～ 35 回繰り返します。

図 1:ポリメラーゼ連鎖反応

PCR の産物は、DNA ラダーと比較して、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画されます。アガロースゲル上での DNA の可視化は、臭化エチジウムで染色し、UV で観察することによって行われます。臭化エチジウム染色ゲルの UV で増幅された DNA バンドを図 2 に示します。 DNA ラダーは一番左のウェルに表示されています。

図 2:DNA バンド

RT-PCR とは

RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 ) は、mRNA の検出に使用される最も感度の高い技術の 1 つです。 RNA は、正常組織の遺伝子発現または感染組織の遺伝子発現に関する情報を収集するための適切なテンプレートです。 RT-PCR のテンプレートは、それぞれトータル RNA またはウイルスまたは細菌 RNA のいずれかです。 RNA は、酵素である逆転写酵素によって相補的 DNA (cDNA) に逆転写されます。逆転写酵素の至適温度は 46 °C です。 ｃＤＮＡは、産物を得るためにＰＣＲで使用される。逆転写 PCR の手順を 図 3 に示します。 .

図 3:RT-PCR

RT-PCR は、2 ステップまたは 1 ステップの反応で実行できます。 2 段階反応では、逆転写と PCR が 2 つの別々の段階で実行されます。ワンステップ RT-PCR では、逆転写の後に 1 つのチューブ内で連続的に PCR が行われます。サイズ分画と視覚化の目的で、cDNA と最終 PCR 産物の両方をアガロースゲルで実行できます。 1 ステップおよび 2 ステップの RT-PCR を図 4に示します。

図 4:1 ステップおよび 2 ステップの RT-PCR

PCR と RT-PCR の違い

定義

PCR: PCR は、DNA 配列の何百万ものコピーを生成する DNA のセグメントを増幅する分子生物学で使用される技術です。

RT-PCR: RT-PCR は、分子生物学における遺伝子発現の検出に使用される PCR の変種です。

手順

PCR: 変性、アニーリング、および伸長は、PCR の 3 つのステップです。

RT-PCR: RT-PCR では、逆転写の後に PCR が続きます。

テンプレート

PCR: 二本鎖 DNA 分子は、PCR のテンプレートとして機能します。

RT-PCR: 一本鎖 RNA 分子は、逆転写のテンプレートとして機能します。一本鎖 DNA 分子は、PCR のテンプレートとして機能します。

使用する酵素

PCR: PCR の酵素として DNA ポリメラーゼが使用されます。

RT-PCR: 逆転写酵素と DNA ポリメラーゼは、RT-PCR の酵素として使用されます。

プライマー

PCR: PCRにはフォワードプライマーとリバースプライマーが使用されます。

RT-PCR: 逆転写にはリバース プライマーのみを使用し、PCR にはフォワード プライマーとリバース プライマーの両方を使用します。

感度

PCR: PCR は繊細な方法です。

RT-PCR: RT-PCR は PCR より感度が高いです。

アプリケーション

PCR: PCR は、遺伝子の機能分析、遺伝性疾患の診断とモニタリング、DNA クローニング、DNA 配列決定、および古代の DNA 増幅に使用されます。

RT-PCR: RT-PCR は遺伝子発現の検出に使用されます。

結論

PCR と RT-PCR は、分子生物学で使用される 2 つの重要な技術です。 PCR と RT-PCR はどちらも、フォワード プライマーとリバース プライマーによって定義されるターゲット DNA 配列のコピー数を指数関数的に増加させることができる自動化された技術です。 PCR では、二本鎖 DNA がテンプレートとして使用されます。 PCR により、DNA クローニング、DNA 配列決定、および遺伝子の機能解析を行うことができます。 RT-PCRでは、RNAを増幅することで特定の組織における遺伝子発現を観察することができます。 PCR と RT-PCR の主な違いは、各反応で使用されるテンプレートとそのアプリケーションにあります。

参照:

1.「ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)」。国立バイオテクノロジー情報センター。米国国立医学図書館、n.d.ウェブ。こちらから入手できます。 2017 年 6 月 1 日。
2.「ポリメラーゼ連鎖反応 (または PCR)」。遺伝子のクローニングと分子解析。 N.p.、n.d.ウェブ。こちらから入手できます。 2017 年 6 月 1 日.
3. Biolabs、ニュー イングランド。 「cDNA合成とRT-PCR。」 cDNA合成とRT-PCR | NEB。 N.p.、n.d.ウェブ。こちらから入手できます。 2017 年 6 月 1 日

画像提供:

1.「ポリメラーゼ連鎖反応」エンゾクロップ著 – 自身の作品 (CC BY-SA 3.0)、コモンズ ウィキメディア経由
Rainis Venta – 自作 (CC BY-SA 3.0)、Commons Wikimedia 経由
3. 「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」 Jpark623 著 – 自作 (CC BY-SA 3.0)、Commons Wikimedia 経由
4. 「1 ステップ vs 2 ステップ RT-PCR」Jpark623 著 – Commons Wikimedia 経由の自作 (CC BY-SA 3.0)