オリゴ dT とキャリアの組み合わせは、主にアフィニティー クロマトグラフィーとして知られる手法による全 RNA からの mRNA の精製に使用されます。細胞の種類に基づいて、トータル RNA から mRNA を分離するには、主に 2 つの方法があります。すなわち、ｍＲＮＡ単離の直接法およびｍＲＮＡ単離のマイナス法である。この記事では、両方の方法について説明します。
メッセンジャー RNA (mRNA) は、一連の RNA ヌクレオチドで構成される転写産物です。タンパク質の合成のために、核から細胞質まで遺伝子の情報を運びます。特定の細胞株から RNA を分離すると、mRNA とともに rRNA と tRNA で構成されるトータル RNA が得られます。したがって、mRNA は、細胞株のトランスクリプトームの研究中に全 RNA の混合物から分離する必要があります。 mRNA 分子の 3' 末端にあるポリ (A) テールの存在など、mRNA の固有の特性が分離に使用されます。オリゴ dT 分子はポリ (A) テールに相補的であるため、mRNA は全 RNA の混合物から分離できます。
対象となる主な分野
1. mRNAとは
– 定義、構造、機能
2.トータル RNA の組成とは
– mRNA、rRNA、tRNA
3.トータル RNA から mRNA を分離する方法
– オリゴ dT/キャリア分子の使用
重要な用語:アフィニティ クロマトグラフィー、メッセンジャー RNA (mRNA)、マイナス法、オリゴ dT、ポリ (A) テイル、トータル RNA
mRNA とは
mRNA は、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物です。真核生物の核内で産生され、特定のタンパク質の産生に関する情報を細胞質に運びます。リボソームの助けを借りて、翻訳中にタンパク質のアミノ酸配列に翻訳されます。真核生物の転写によって生成される一次転写産物は、mRNA 前駆体と呼ばれます。
図 1:mRNA の構造
転写後修飾中に、5' キャップやポリ (A) テールなどのいくつかの特徴を持つ成熟した mRNA 分子が生成されます。特定の生物の全 mRNA は、そのトランスクリプトームとして知られています。
Total RNA の組成とは
RNA 分離の結果は、total RNA と呼ばれます。これは、細胞によって生成される 3 つの主要な種類の RNA のすべてで構成されています。それらはmRNA、tRNA、およびrRNAです。 tRNA と rRNA の両方が翻訳を助けます。真核生物の mRNA のサイズは 0.5 ～ 20 kb です。トランスファー RNA (tRNA) は、翻訳中に対応するアミノ酸をもたらします。長さは 76 ～ 90 塩基対で、mRNA 上の特定のコドンに相補的なアンチコドン領域で構成されています。リボソーム RNA (rRNA) は、リボソームの構成要素です。ヒト rRNA の中には長さが 5 kb のものもあります。
全 RNA の 90% 以上が tRNA と rRNA で構成されています。全 RNA のわずか 1 ～ 5% が mRNA です。典型的な哺乳類細胞は、細胞あたり約 500,000 の mRNA 分子で構成されています。特定の種類の mRNA の量は、1 細胞あたり 15 ～ 20,000 コピーです。
Total RNA から mRNA を分離する方法
cDNA ライブラリーの構築、マイクロアレイ調製のためのサンプル調製、発現の弱い遺伝子のノーザンブロット解析など、多くの分子生物学的手法には高品質の mRNA が必要です。全 RNA から mRNA を分離するには、細胞の種類によって主に 2 つの方法があります。mRNA 分離の直接法と mRNA 分離のマイナス法です。
mRNA 分離の直接法
真核生物の全 RNA から成熟した mRNA を分離する原理には、オリゴ dT (オリゴデオキシチミジレート) を使用したポリアデニル化 mRNA のアフィニティー選択/アフィニティークロマトグラフィーが含まれます。ポリ（A）テール。これは、tRNA と rRNA という他の 2 種類の RNA にポリ (A) テールがないことによって可能になります。
mRNA は、その poly(A) テールにある 30 ～ 200 のアデニン ヌクレオチドで構成されています。オリゴ dT/キャリアの組み合わせで満たされたアフィニティ カラムは、全 RNA からの mRNA の分離に使用されます。オリゴ dT/担体の組み合わせは、セルロース結合オリゴ dT、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを含むビオチン化オリゴ dT、またはオリゴ dT 結合ポリスチレン ラテックス ビーズのいずれかです。 RNA の酵素分解を防ぐため、すべての実験条件は RNase フリーの条件にする必要があります。
図 2:アフィニティ クロマトグラフィー
Total RNA を高塩濃度バッファーに溶解し、65 ～ 70 °C に短時間加熱して RNA の二次構造を破壊します。 RNA の分離条件は、mRNA 分離用の市販のキットによって異なります。ただし、poly(A)-RNA または mRNA の調製は 3 つのステップで構成されます。
<オール>マイナス mRNA 分離法
mRNA のオリゴ dT ベースの精製では、ポリ (A) テールを持つ mRNA または成熟した真核生物の mRNA しか得られません。したがって、マイナス法として知られる別の方法は、ポリ（A）テールを持たないmRNAの精製に使用できます。この方法は、酵母および細菌の全 RNA からの mRNA の分離に使用できます。また、真核細胞からの成熟mRNAとともに、未成熟タイプのmRNAの分離にも使用できます。これには、全 RNA から大きなリボソーム RNA を枯渇させることによるトランスクリプトームの濃縮が含まれます。 ThermoFisher Scientific の RiboMinus Transcriptome Isolation キットは、3 つのステップを使用して、酵母および細菌の全 RNA から効率的に mRNA を精製します。
<オール>結論
トータル RNA は、mRNA、rRNA、tRNA の 3 つの主なタイプの RNA で構成されています。特定の生物のトランスクリプトームの解析には、トータル RNA からの mRNA の精製が不可欠です。精製方法はmRNAの種類によって異なります。ポリ (A) テールを含む真核生物の mRNA は、オリゴ dT を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって分離できます。未熟な真核生物の mRNA および酵母や細菌細胞からの mRNA は、全 RNA から大きな rRNA を除去することで分離できます。
参照:
1.「mRNA抽出」。サーモフィッシャーサイエンティフィック、こちらから入手できます。
2.「RNAの種類によるRNA抽出」サーモフィッシャーサイエンティフィック、こちらから入手可能
画像提供:
1. Commons Wikimedia 経由の「成熟した mRNA」(CC BY-SA 3.0)
2. English Wikibooks の Jamit による「Affinity」 – Commons Wikimedia 経由で CommonsHelper (パブリック ドメイン) を使用して、Adrignola によって en.wikibooks から Commons に転送されました
/P>
