定量的またはリアルタイム PCR は、さまざまな実験条件下での遺伝子発現の相対的な変化を監視するための日常的なアッセイとして使用されます。 QPCR 中のプライマーとプローブの設計は、アッセイの品質と成功に影響を与える最も重要な要素の 1 つです。 QPCR 用のプライマーの設計には、いくつかのガイドラインが適用されます。プライマーの GC 含有量は 35 ～ 65% にする必要があります。プライマーの融解温度は 60 ～ 68 °C の範囲内である必要があります。また、二次構造、3 塩基より長い G または C の反復、およびプライマーダイマーの形成も避ける必要があります。
対象となる主な分野
1. QPCRとは
– 定義、プロセス、用途
2. QPCR 用プライマーの設計方法
– QPCR のプライマー設計のガイドライン
重要な用語:蛍光色素、GC 含有量、融解温度、プライマー、定量的 PCR (QPCR)
QPCR とは
QPCR は、リアルタイムで産物を定量できる PCR の一種です。蛍光色素は、各ステップでそれらを標識することにより、PCR 産物の定量化に使用できます。 QPCR アッセイでは、2 つの蛍光標識法を使用できます。それらは、蛍光色素と蛍光標識プローブの使用です。蛍光色素は PCR 産物に結合し、プローブは PCR 産物とアニールして安定した三重鎖 DNA を形成します。 QPCCR で広く使用されている蛍光色素は SYBR Green ですが、プローブは Taqman にすることができます。 QPCR 中の PCR 産物の検出にプローブを使用すると、より正確な結果が得られ、アッセイの感度が向上します。
図 1:QPCR のメカニズム
QPCR 用プライマーの設計方法
QPCR のプライマーの設計は、信頼性、精度、およびアッセイの感度を向上させる上で非常に重要です。 QPCR プライマーの設計に関するガイドラインを以下に示します。
<オール>Primer3、Primer-BLAST、IDT PrimerQuest、Primer Bank、OAT など、いくつかのオンライン ツールを QPCR のプライマー設計に使用できます。
図 2:プライマー - ダイマーの形成
QPCR でプライマーダイマーが形成されないように、プライマーを設計する必要があります。 PCR 産物の検出に蛍光色素を使用する場合、これらの色素もプライマーダイマーと結合して偽陽性の結果をもたらすため、これは重要です。
結論
QPCR は、PCR 産物の検出と定量化に使用されます。プライマーの設計は、QPCR で結果の精度を高めるために非常に重要です。したがって、QPCR 用のプライマーを設計する際にはガイドラインに注意深く従うことが重要です。
参照:
1.「QPCR アッセイの設計と最適化」。 LSR |バイオ・ラッド、こちらから入手できます。
