生物圏は主に微生物ですが、微生物界のほとんどはまだ未知の世界です。 .しかし、それは変化しています。メタゲノミクスとマイクロバイオミクス (それぞれ環境と人間からサンプリングされた微生物のシーケンスに基づく集計) は、過去 10 年間で研究と宣伝が爆発的に増加しました。しかし、彼らは主にバクテリアに焦点を当てています。原生生物 — 事実上すべての湿った環境で見られる多様な単細胞真核生物の総称 — は、どこにでもあり、生態学的に重要であり、医学的にも重要であるにもかかわらず、あまり注目されていません.
たとえば、緑藻などの光合成原生生物は、地球の主要な酸素生産者の 1 つであり、水生食物連鎖の基盤です。アメーバやゾウリムシなどの非光合成の対応物は、水生および陸生の食物連鎖の基本であり、バクテリアの捕食者でもあります。それらはまた、自由生活モードと、セルロースを分解する特定の昆虫の腸の共生生物としての両方で、有機物の重要な分解者です。一部の原生生物種は、宿主の植物や動物との寄生関係や病原性の関係を進化させ、壊滅的な公衆衛生と経済的結果をもたらしています。これらには、マラリア、下痢性疾患、睡眠病、リーシュマニア症として知られている惨劇を引き起こす種、および腸内寄生虫 Giardia などの致命的ではないが一般的で衰弱させる病原体が含まれます 性感染症の寄生虫Trichomonas vaginalis。 病原性原生生物の多くは人獣共通感染症でもあります。つまり、動物から人間に伝染する可能性があります。これは、公衆衛生にとって懸念される特性です。
「オミクス」調査で原生生物が比較的無視されている理由の1つは、細菌に焦点を当てた研究とは対照的に、分類学的に多様なサンプルで原生生物のDNAを特異的に分析するための標準化されたプロトコルとマーカーがないことです。マイクロバイオームのサンプルでは、圧倒的な量の宿主と細菌の DNA の中で原生生物の配列を区別する必要があります。環境サンプルのメタゲノム調査では、バクテリア、ウイルス、菌類、植物、動物の配列と同様に注意を引くために競合します。そのような環境の 1 つに下水があります。これは、人間が住んでいる場所を循環する人畜共通原生生物を監視するのに役立つ可能性があるソースです。しかし、生の下水におけるそれらの多様性を正確に推定することは、手ごわい挑戦です.
生下水に含まれる人獣共通原生生物の配列決定
最近の論文では、ニューヨーク大学のゲノミクスおよびシステム生物学センターの研究者がこの課題に取り組みました。彼らは、特に人畜共通種に焦点を当てて、下水中の原生生物を検出するためのシーケンスベースのワークフローを開発および最適化しました。最初に、彼らは、18S リボソーム RNA の 2 つの可変領域 V4 と V9 に対する「ユニバーサル」PCR プライマーの有用性を評価しました。このプライマーは、真核生物の多様性の研究でよく使用され、混合分類群の既知のセットで原生生物を識別します。この「モック コミュニティ」を作成するために、原生生物、菌類、脊椎動物の 23 種から V4 および V9 領域を増幅および配列決定し、配列を 1 つのセットに組み合わせ、QIIME 微生物群集分析ソフトウェア パッケージのクラスタリング アルゴリズムを使用してそれらを盲目的にグループ化しました。 OTU (O 理科 T 軸索 U nits) 類似性による。彼らは、比較のために V4 と V9 シーケンスを別々にこれを行い、それぞれ 20 と 18 の OTU を生成しました。
次に、OTUは、その配列を公開されたSILVA rRNA配列データベースの参照配列と照合することにより「命名」されました（原生生物の配列範囲を修正および改善するためにキュレーションが必要であることが証明されました）。次に、ソフトウェアによって割り当てられた名前が、各 OTU 内のシーケンスの実際の既知のソースと比較されました。 20 個の V4 OTU すべてが属レベルで正しく識別され、1 つを除くすべてが種レベルで正しく識別されました。 18 個の V9 OTU のうち、16 個が属レベルで、11 個が種レベルで正しく識別されました。これらの結果は、両方の 18S rRNA 領域が、分類学的に広範囲にわたる配列の混合物内で、しばしば種レベルまで、原生生物を解決できることを示しました。
Maritz 他 .次に、ニューヨーク市の集合住宅の流出物からのサンプルを使用して、生の下水の原生生物調査用に最適化されたパイプラインの開発に V4 および V9 プライマーを組み込みました。パイプラインには、サンプル収集、DNA 抽出、18S rRNA PCR および V4 および V9 DNA ライブラリーの調製、イルミナ ディープ シーケンス、イルミナ リードの処理、OTU 生成、および分類学的およびコミュニティの多様性分析のための最適化されたステップが含まれます。試行錯誤を経て、彼らは、PCR 増幅ステップ中に脊椎動物ブロッキングプライマー (驚くべきことに、無脊椎動物配列もブロックした) の使用と組み合わせて、1 ml 容量の新鮮で凍結していない下水から同日に DNA を抽出すると、 DNA収量と原生生物の検出範囲のベストバランス。 V4 と V9 の両方のプライマー セットをサンプルに使用することをお勧めします。これは、それらの検出能力が重複し、互いに補完し合うためです。
自由生活細菌を食べる繊毛虫と鞭毛虫は、下水の原生生物成分を支配することがわかったが、さまざまな寄生性、人獣共通感染症、および潜在的に病原性の原生生物の DNA シグネチャも、トリコモナス由来の人間の腸に感染する原生生物を含む、より低いレベルで検出された (ペンタトリコモナス )、アメーバ (Entamoeba )、アピコンプレキサン (クリプトスポリジウム ) とヘテロコント (ブラストシスチス ) 系統、鳥のトリコモナス、猫/人間の寄生虫 トキソプラズマ .
生の下水からの多くの OTU が未確認になったことは事実であり、更新された 18S データベースにギャップが残っていることを示しており、推論により、微生物の真核生物の世界の配列範囲にギャップが残っていることを示しています。シーケンシングに基づく調査では、検出された生物が生きているか死んでいるかを知ることはできず、それらは必然的に、おそらく頻繁に変化する個体群の「スナップショット」にすぎません。しかし、マリッツらによって使用された方法。下水中の原生生物の個体数の経時的な傾向を追跡する実行可能な方法を約束します。これは、公衆衛生に恩恵をもたらす可能性があります。
これらの調査結果は、Microbial Ecology 誌に掲載された、ズーノティック トリコモナスに焦点を当てた、下水で原生生物を特徴付けるための 18S rRNA ワークフローというタイトルの記事で説明されています。 .この作業は、ニューヨーク大学のジュリア マリッツとジェーン カールトンが主導しました。
