イルミナシーケンシングの仕組み

イルミナのシーケンスは、「sequencing-by-synthesis」とも呼ばれる次世代のシーケンス方法です。 " 方法。イルミナのシーケンスは、何百万ものフラグメントを並行して処理することに関与しています。イルミナのシーケンシング ワークフローに含まれる 4 つの基本的なステップは、ライブラリの準備、クラスターの生成、シーケンシング、およびデータ解析です。これらについては、この記事で詳しく説明します。

対象となる主な分野

1.イルミナシーケンシングとは
– 定義、事実、利点
2.イルミナのシーケンシングの仕組み
– イルミナシーケンシングのプロセス:
– ライブラリの準備
– クラスター生成
– シーケンシング
– データ分析

重要な用語:クラスター生成、データ解析、イルミナ シーケンス、ライブラリーの準備、合成によるシーケンス

イルミナ シーケンシングとは

イルミナのシーケンシングまたは合成による配列決定 (SBS) 技術は、世界で最も広く使用されている次世代シーケンシング技術です。世界のシーケンスデータの 90% 以上がイルミナのシーケンスによって生成されています。もともとは、ケンブリッジ大学の Shankar Balasubramanian と David Klenerman によって開発されました。彼らは 1998 年に Solexa として知られる会社を設立しました。その後、イルミナは 2007 年に Solexa を買収し、元の技術を急速に改善しました。したがって、この方法は Solexa/Illumina シーケンス法とも呼ばれます .イルミナ シーケンスの主な利点は、エラーのない読み取りが高収率で得られることです。

イルミナ シーケンスの仕組み

イルミナのシーケンシングに含まれる 4 つのステップを以下に説明します。

ステップ 1. ライブラリの準備

• 同時タグ付けによりシーケンスライブラリを作成 タグメンテーションとして知られるプロセスで、トランスポザーゼによって DNA を 200 ～ 600 塩基対の短いセグメントに変換し、続いて DNA の短いセグメントの 3' 末端と 5' 末端の両方にアダプターをライゲーションします。
• シーケンシング プライマーの結合部位、インデックス、およびフロー セル オリゴに相補的な領域などの追加のモチーフが、短縮サイクル増幅によってアダプターの両側に追加されます . 図 1 にタグ付けとモチーフの追加を示します .

図 1:タグ付けとモチーフの追加

ステップ 2. クラスターの生成

• 準備されたシーケンス ライブラリが変性され、フロー セルにロードされます クラスタ生成用。クラスターの生成中に、シーケンス ライブラリ内の各フラグメントが等温増幅されます。フローセルは、レーンを含むガラスで構成されています。各レーンは 2 種類のオリゴヌクレオチドでコーティングされています。 １つのタイプは、追加モチーフの５'領域に相補的であり、もう１つのタイプは、調製されたライブラリーの追加モチーフの３'領域に相補的である。したがって、これらのオリゴは、シーケンス ライブラリ内の対応する DNA 領域に結合します。 図 2 に、2 種類のオリゴを含むフローセルを示します。 .シーケンス ライブラリの 5' 領域に結合するオリゴはピンク色で、シーケンス ライブラリの 3' 領域に結合するオリゴは緑色です。

図 2:フロー セル

• 一本鎖配列決定ライブラリがオリゴに結合されると、相補鎖が DNA ポリメラーゼによって生成されます。次に、得られた二本鎖 DNA が変性され、元の鎖が洗い流されます。
• クローン増幅 フラグメントのブリッジ増幅によって達成されます .このプロセス中に、ストランドはフローセル上の 2 番目のタイプのオリゴの上に折り畳まれます。次に、ポリメラーゼが二本鎖ブリッジを合成します。ブリッジの変性により、2 本の DNA 鎖が生じます。フローセルのオリゴでは、フォワード鎖とリバース鎖の両方です。
• ブリッジ増幅は何度も繰り返され、クローン増幅によって配列決定ライブラリー内のすべてのタイプのフラグメントの何百万ものクラスターを同時に取得します。クローン増幅は 図 3 に示されています .

図 3:クローン増幅

• その後、リバース ストランドが洗い流され、フロー セル上にフォワード ストランドのみが保持されます。フォワード ストランドでは、3' 末端は遊離しており、不要なプライミングを防ぐためにブロックされています。

ステップ 3. シーケンス

逆シーケンスの最初の読み取り

• シーケンスは、最初のシーケンス プライマーの拡張子から始まります .イルミナのシーケンス法では、デオキシリボース糖の 3' 位置にターミネーターを含む修飾 dNTP を使用します。これらの dNTP もさまざまな色で蛍光標識されています。

• 各相補的ヌクレオチドの付加後、フローセル内のクラスターの蛍光発光が観察されます。

• 光の検出後、蛍光体を洗い流すことができます。

• 次に、糖の 3' 位置のターミネーター グループがヒドロキシル基によって再生され、成長している鎖に 2 番目の dNTP を付加できるようになります。このプロセスは、合成による配列決定として知られています。 図 4 は、合成による配列決定を示しています。

図 4:合成による配列決定

• 合成の完了時に、逆シーケンスの最初の読み取り が得られ、配列決定産物が洗い流されます。

インデックス 1 読み取り

• 次に、インデックス 1 プライマーをクラスターにハイブリダイズさせて、合成による配列決定によって同じ方法で 2 番目の読み取りを生成します。シーケンス生成物が洗い流されます。

インデックス 2 読み取り

• その後、クラスターの 3' 末端が脱保護され、3' 末端とフローセル上の 2 番目のタイプのオリゴ (緑色) とのハイブリダイゼーションが可能になります。これにより、インデックス２領域の配列が得られる。シーケンス生成物が洗い流されます。

フォワード シーケンスの 2 回目の読み取り

• 2 番目のタイプのオリゴは、ポリメラーゼによって伸長され、二本鎖ブリッジを形成します。ブリッジが変性し、3' 末端がブロックされています。前鎖は洗い流されます。
• フォワード シーケンスの 2 番目の読み取り は、2 番目のシーケンシング プライマーのハイブリダイゼーションと伸長による合成によるシーケンシングによって得られます。

ステップ 4. データ分析

• シーケンスによって取得された数十億のリードは、インデックス シーケンスに基づいてグループ化されます。
• 次に、同様のリードを持つシーケンスがクラスター化されます。
• 順方向読み取りと逆方向読み取りがペアになって、連続したシーケンスを形成します。
• あいまいなアラインメントは、ペア シーケンスによって解決できます。
• バリアントの識別のために、連続した配列がリファレンス ゲノムにアラインメントされます。

次のビデオでは、イルミナ シーケンスの完全なプロセスについて説明しています。

結論

イルミナのシーケンシングは、次世代のシーケンシング方法です。イルミナのシーケンシングは、DNA の 200 ～ 600 塩基対の長さの断片を含むシーケンシング ライブラリの調製に関与しています。イルミナのシーケンスに含まれる 4 つのステップは、ライブラリの準備、クラスターの生成、シーケンス、およびデータ解析です。イルミナのシーケンシングは高い精度でシーケンス リードを提供するため、世界中で広く使用されているシーケンシング方法です。

参照:

1.「合成による配列決定（SBS）技術」。 シーケンシング技術 |合成による配列決定 、ここから入手できます。

画像提供:

1. DMLapato による「DNA 処理の準備」 – Commons Wikimedia 経由の自作 (CC BY-SA 4.0)
2. DMLapato による「フローセル内のオリゴヌクレオチド鎖」 – Commons 経由の自作 (CC BY-SA 4.0)ウィキメディア
3.「合成によるシーケンシング リバーシブルターミネーター」Abizar Lakdawalla (講演) – 私はこの作品を完全に自分で作成しました (CC BY-SA 3.0)、コモンズ ウィキメディア経由
4.「クラスター生成」DMLapato 著– Commons Wikimedia による自身の作品 (CC BY-SA 4.0)