1。関心の遺伝子のクローニング：
* 遺伝子を取得します： これは、さまざまな方法で実行できます。
* PCR増幅： 特定のプライマーを使用して、テンプレート（ゲノムDNA、cDNAなど）から遺伝子をコピーします。
* 制限酵素消化とライゲーション： 遺伝子と標的ベクターを特定の酵素で切断し、それらを結合します。
* 遺伝子を合成： 遺伝子配列を化学的に合成します。
* ベクトルへの挿入： 遺伝子は、細菌内で複製できるベクター（プラスミドなど）に挿入されます。このベクトルには、多くの場合、次のような要素が含まれています。
* 複製の起源： ベクターが宿主細菌で複製できるようにします。
* 選択可能なマーカー： 特定の抗生物質に耐性を提供する遺伝子であり、ベクターを運ぶ細菌の選択を可能にします。
* プロモーター： 遺伝子発現を調節し、目的の遺伝子が転写されるようにするシーケンス。
* リボソーム結合部位： リボソームが翻訳を認識して開始するのに役立つシーケンス。
2。変換と選択：
* 細菌を変換： 遺伝子を含むベクターを細菌宿主細胞（例：大腸菌）に導入します。これは、次のような方法で実行できます。
* 熱ショック： 細菌を短時間の熱パルスにさらして、細胞膜の透過性を増加させます。
* エレクトロポレーション： 電気パルスを使用して、細胞膜に一時的な毛穴を作成します。
* 選択： 選択可能なマーカーを使用してベクトルを正常に取り上げた細菌コロニーを選択します。これは通常、マーカーが耐性を提供する抗生物質を含む寒天プレート上で細菌を栽培することを伴います。
3。タンパク質発現：
* 細菌の培養： 形質転換された細菌細胞を、タンパク質の産生に必要な栄養素と状態を提供する適切な培地（例：液体スープ）で成長します。
* タンパク質産生を誘導： 一部のベクトルには誘導性プロモーターがあります。特定の化学物質（IPTGなど）を培養に追加することにより、目的の遺伝子の転写と翻訳を引き起こし、タンパク質産生につながることができます。
* 発現条件を最適化： タンパク質生産を最大化するために、成長条件（温度、pH、通気）を微調整します。
4。タンパク質精製：
* 細胞溶解： 細菌を開いてタンパク質を放出します。これは、次のようなさまざまな方法で実行できます。
* 超音波処理： 音波を使用して細胞壁を破壊します。
* フレンチプレス： 高圧で小さな開口部を強制する。
* 酵素溶解： 酵素を使用して細胞壁を分解します。
* 精製： 細胞成分の複雑な混合物から標的タンパク質を分離します。多くの場合、複数のステップを組み合わせたさまざまな手法が利用可能です。
* クロマトグラフィ： サイズ、電荷、または親和性に基づいて特定のリガンドに基づいてタンパク質を分離します。
* 遠心分離： 密度に基づいてタンパク質を分離します。
* 降水量： 化学物質を使用して、溶液からタンパク質を沈殿させます。
* 分析： 次のような方法を使用して精製されたタンパク質を特徴づける
* sds-page： 純度と分子量を評価する。
* ウエスタンブロッティング： タンパク質の同一性を確認します。
* 機能アッセイ： タンパク質の活性と望ましい特性を確認します。
5。最適化とスケールアップ：
* 最適化： 次のようなパラメーターを調整して、プロセス全体を微調整します。
* 細菌株： 効率的なタンパク質発現で知られている株を選択します。
* ベクトル設計： プロモーターおよびその他の調節要素を最適化します。
* 培養条件： 最適なタンパク質収量のために、温度、pH、および栄養素組成を調整します。
* スケールアップ： タンパク質の需要を満たすために生産量を増やします。これには、多くの場合、より大きな発酵槽とバイオリアクターの使用が含まれます。
重要な考慮事項：
* タンパク質溶解度： 一部のタンパク質は、細菌内の不溶性形態（包含体）で発現する場合があります。これには、タンパク質を可溶化して還元するための特別な技術が必要です。
* 毒性： あなたが生産しているタンパク質は、細菌の宿主に有毒である可能性があり、その生産を管理するために特定の戦略が必要です。
* 翻訳後修飾： タンパク質が細菌に自然に存在しない特定の修飾（グリコシル化など）を必要とする場合、哺乳類細胞のような代替発現システムが必要になる場合があります。
細菌発現の代替：
細菌発現システムは大量のタンパク質を生産するために広く使用されていますが、他のオプションが存在します。
* 酵母システム： 細菌よりも真核生物様であり、より良い折りたたみやグリコシル化能力を提供します。
* 哺乳類細胞株： より正確な翻訳後修飾と複雑なタンパク質のより高い収率を提供できます。
* 昆虫細胞： 抗体などの複雑なタンパク質の発現に使用されます。
発現システムの選択は、特定のタンパク質とその目的の使用に依存します。
