1。タンパク質の抽出と調製：
- 最初のステップは、関心のあるサンプルからタンパク質を抽出することです。これは、細胞溶解や組織の均質化などのさまざまな方法を使用して行うことができ、その後に遠心分離して細胞の破片を除去することができます。
- 次に、抽出されたタンパク質が定量化され、通常はブラッドフォードアッセイまたは同様の方法を使用して、後続のステップで等しいタンパク質負荷を確保します。
2。タンパク質分離：
- タンパク質サンプルは、還元剤（ベータメルカプトエタノールやDTTなど）を含む荷重バッファーと追跡染料（たとえば、ブロモフェノールブルー）と混合されます。
- タンパク質混合物は、電気泳動のためにポリアクリルアミドゲルにロードされます。ゲルは電流にさらされ、そのサイズに基づいてタンパク質が分離されます。より小さなタンパク質はゲルを介してより速く移動しますが、大きなタンパク質はよりゆっくりと移動します。
3。タンパク質移動：
- 電気泳動後、分離されたタンパク質は、ゲルからニトロセルロース膜またはポリジフルオリド（PVDF）膜に移します。タンパク質の吸収剤または電気ブロッティングとして知られるこのプロセスには、ゲルと膜を伝達バッファーに配置し、電流を適用することが含まれます。
- その結果、タンパク質はゲルから膜に伝達され、分離されたタンパク質のレプリカが作成されます。
4。膜ブロッキング：
- 抗体の非特異的結合を減らすために、ニトロセルロースまたはPVDF膜は、ウシ血清アルブミン（BSA）または非脂肪乾燥牛乳などのタンパク質を含む溶液でブロックされます。
- このブロッキングステップは、バックグラウンドシグナルを最小限に抑え、その後のステップ中の抗体結合の特異性を改善するのに役立ちます。
5。一次抗体インキュベーション：
- 膜は、目的のタンパク質を特異的に認識して結合する一次抗体でインキュベートされます。一次抗体は通常、標的タンパク質またはタンパク質内の特定のエピトープに対して生成されます。
- これらの抗体は適切なバッファーで希釈され、膜とインキュベートされ、標的タンパク質に結合できるようにします。
6。洗濯：
- 一次抗体インキュベーションの後、膜を完全に洗浄して、非結合抗体を除去し、バックグラウンドシグナルを減らします。この洗浄ステップは、標的タンパク質の特定の検出を確保するために重要です。
7。二次抗体インキュベーション（レポーター酵素と共役）：
- 西洋ワシンペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ（ALP）などの酵素に結合した二次抗体を使用して、膜上の原発性抗体 - 抗原複合体を検出します。
- 二次抗体は種固有のものであり、特定の種（マウスやウサギなど）で産生される一次抗体を認識して結合することを意味します。
- 酵素結合二次抗体は一次抗体に結合し、シグナルの増幅と視覚化を可能にする複合体を作り出します。
8。洗濯：
- 未結合の二次抗体を除去し、バックグラウンドシグナルを削減するために、別の洗浄ステップが実行されます。
9。化学発光検出：
- HRP結合二次抗体の場合、化学発光基質が膜に添加されます。基質がHRPと反応すると、光が発生します。
- 特殊な化学発光検出システムまたはX線フィルムは、放出された光信号をキャプチャして視覚化するために使用されます。光の強度は、サンプルに存在するターゲットタンパク質の量に対応します。
10。データ分析と解釈：
- 開発されたX線フィルムまたはデジタル化学発光画像を分析して、標的タンパク質に対応するバンドまたはスポットを特定します。
- これらのバンドのサイズと強度は、検出されたタンパク質の分子量、存在量、および翻訳後の修飾に関する情報を提供できます。
これらの手順に従うことにより、ウエスタンブロッティングにより、タンパク質の複雑な混合物における関心のあるタンパク質の特定の検出と分析が可能になります。分子生物学、免疫学、臨床診断など、生物学的研究のさまざまな分野で広く使用されています。
