細胞溶解：
- 溶解手順は、通常、NaOHを含む緩衝液中の細菌細胞の再懸濁から始まります。このバッファーは、通常はpH 12-12.8前後の高いpHを持つアルカリ環境を作成します。
- この高いpHでは、細菌の細胞膜と細胞壁が破壊され、細胞溶解が発生します。プラスミドDNAを含む細胞成分は、溶解物に放出されます。
染色体DNAの変性：
-NAOHによって作成された高いpH環境は、細菌の染色体DNAを標的にし、変性させます。染色体DNAは通常、大きくて複雑で、単一の円形分子で構成されています。
- 強いアルカリ条件により、相補的なDNA鎖間の水素結合が壊れ、染色体DNAの変性と断片化が生じます。この変性は、染色体DNAの構造的完全性を効果的に破壊し、それを非機能的にします。
プラスミドDNAの保存：
- 染色体DNAとは対照的に、プラスミドDNAはNaOHによる変性により耐性があります。プラスミド分子は通常、小さく、円形で、二本鎖であり、安定性を高める超コイル構造を備えています。
- プラスミドDNAのスーパーコイル化立体構造により、染色体DNAよりもアルカリ疾患に耐えることができます。したがって、染色体DNAは変性しますが、プラスミドDNAは無傷のままであり、その共有結合閉じた円形構造を維持します。
中和：
- 溶解ステップの後、変性染色体DNAおよび無傷のプラスミドDNAを含む溶解物は、Tris-HClや酢酸緩衝液などの中和剤を含む緩衝液を使用して中和されます。
- 中和により、溶解物のpHが生理学的範囲、通常はpH 7-8前後に戻ります。このステップは、変性プロセスを停止し、プラスミドDNAの安定性を確保するために不可欠です。
プラスミドDNAの分離：
- 中和後、溶解物をさらに処理してプラスミドDNAを分離できます。これには、他の細胞成分からプラスミドDNAを分離するための遠心分離、精製、サイズベースの分離技術などの追加のステップが含まれる場合があります。
プラスミドDNAの完全性を維持しながら染色体DNAを選択的に変性させることにより、NaOHは溶解手順で重要な役割を果たし、DNAシーケンス、クローニング、および遺伝子工学実験を含むさまざまな下流のアプリケーションの共有結合閉じたプラスミド分子の効率的な分離を可能にします。
