サイト指示された突然変異誘発のためのプライマーを設計する方法

部位特異的突然変異誘発 (SDM) は in vitro 既知の配列に突然変異を作成する方法。多くの場合、PCR ベースの方法で実行されます。通常、部位特異的突然変異誘発では、1 つまたは 2 つの塩基が変化します。プライマーは、ヌクレオチド配列に小さな変化を導入するための目的の変異を使用して設計できます。プライマー伸長と逆 PCR を使用して、大規模な変異を導入できます。このアプローチは、特定のタンパク質のアミノ酸組成を変更する可能性があります。部位特異的突然変異誘発は、タンパク質の活性の変化を研究するために使用されます。また、融合タンパク質の作成にも使用されます。

対象となる主な分野

1.部位特異的突然変異誘発 (SDM) とは
– 定義、役割、方法
2.部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの設計方法
– 置換、削除、挿入

重要な用語:欠失、挿入、突然変異、部位特異的突然変異誘発、置換、従来の PCR

部位特異的突然変異誘発とは

部位特異的突然変異誘発は、遺伝子のヌクレオチド配列に特定の変化を導入するために使用される分子生物学的手法です。タンパク質のアミノ酸配列の変更、制限部位の導入または除去、転写結合部位の破壊、融合タンパク質の作成に使用されます。

プロセス

部位特異的突然変異誘発中に、目的の突然変異からなるプライマーを使用して突然変異がプラスミドに導入されます。テンプレート全体が PCR によって増幅され、変異がテンプレートに組み込まれます。次に、酵素、メチル化依存性エンドヌクレアーゼを使用して、サンプルから親テンプレートを除去します。所望の変異を有するＰＣＲ産物またはニックの入ったプラスミド分子は、細菌に形質転換される。プラスミドは、所望の改変を加えて細菌から単離することができる。部位特異的突然変異誘発のプロセスを 図 1 に示します .

図 1:部位特異的突然変異誘発

部位特異的突然変異誘発で目的の突然変異を導入するには、主に 3 種類の方法が使用されます。それらは、従来の PCR、プライマー伸長、および逆 PCR です。プライマー伸長と逆 PCR を使用して、大規模なヌクレオチド変化を導入できます。

従来の PCR

従来の PCR は、修飾プライマーを使用して、標的配列に 1 つまたは 2 つのヌクレオチド変化を導入するために使用できます。変化は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加であり得る。変異は PCR 中にアンプリコンに組み込まれます。したがって、元の配列は、プライマー内の変異配列に置き換えられます。

プライマーエクステンション

プライマー伸長では、ネステッド PCR 中に目的の変異が組み込まれます。ここでは、ターゲット シーケンスは 2 つのプライマーに隣接しています。所望の変異が内部プライマーに組み込まれ、その変異が 2 番目の PCR ラウンドで導入されます。一般に、PCR 反応の特異性は、プライマー内のミスマッチ ヌクレオチドの数が増えると低下します。ただし、ネステッド PCR は PCR 反応の特異性を高める可能性があるため、大規模な変異を含む長い内部プライマーをプライマー伸長に使用できます。

逆 PCR

逆 PCR は、既知の DNA 配列に対するプライマーを設計することにより、未知の DNA 断片を増幅する方法です。大規模なヌクレオチドの置換、削除、または挿入に使用できます。

部位特異的突然変異誘発の適用については以下に説明します。

部位特異的突然変異誘発用プライマーの設計方法

部位特異的突然変異誘発は、プライマーによって目的の突然変異を導入するプロセスです。突然変異は、置換、挿入、または欠失である可能性があります。 PCR の特異性は、プライマー内のミスマッチ ヌクレオチドの増加に伴って低下するため、従来の PCR では、標的配列に 1 つまたは 2 つの塩基対の変化しか導入できません。プライマー伸長や逆 PCR などの他の方法を使用して、大規模な変異を導入することができます。部位特異的突然変異誘発におけるプライマー設計は、図 2 に示されています。 .

図 2:部位特異的突然変異誘発用プライマー

置換

置換の場合、2 つのプライマーのうちの 1 つに、プライマーの中間に目的の変異が含まれている必要があります。ここで、変異を含む部位は、歪みを形成するため、標的配列にアニーリングしません。

削除

削除の場合、ターゲットから削除される配列は、プライマー設計中に無視できます。この配列はプライマーによって隣接領域から離れているため、PCR 中に増幅されません。

挿入

挿入の場合、追加する配列は、プライマー設計時にいずれかのプライマーの 5' 末端に絡み合っています。したがって、挿入された配列もアンプリコンに結合したままになる可能性があります。

結論

部位特異的突然変異誘発は、DNA 配列に突然変異を導入するために使用される技術です。これらの変異は、置換、挿入、または削除である可能性があります。従来の PCR では、小規模な変異を導入することができます。大規模な変異は、プライマー伸長または逆 PCR で導入できます。突然変異の導入は、所望の突然変異をプライマーに組み込むことによって行われる。

参照:

1.「部位特異的突然変異誘発の方法」。 統合された DNA テクノロジー 、ここから入手できます。

画像提供:

1. Knbusbyによる「Site Directed Mutagenesis」 – Commons Wikimedia経由の自身の作品（パブリックドメイン）