DNA シーケンス
DNAシーケンシングについて聞いたことがありますか？たとえば、ヒトゲノム配列決定は、何年にもわたる国際的な取り組みの後、2003 年に達成されました。しかし、ゲノムや DNA の小さな断片の配列決定とは何を意味するのでしょうか?
DNA 配列決定とは?
DNA 配列決定は、DNA のチャンク内のヌクレオチドの塩基の配列を認識しています。言い換えれば、DNA 配列決定とは、DNA の分子を形成する「塩基」として知られる DNA の 4 つの基本構成要素の配列を見つけることを意味します。この配列は、DNA の特定のセグメントに含まれる遺伝情報の種類を科学者に知らせます。科学者が配列決定情報を利用して、DNA のどの部分に遺伝子が含まれているか、またどの部分に遺伝子のオンとオフを切り替えるための制御命令が含まれているかを調べることができるとします。さらに、重要なことに、配列データは、病気につながる可能性のある遺伝子の変化を明らかにすることができます.
DNA の二重らせん構造では、DNA の 4 つの塩基は常に同じ塩基と対になって「塩基対」を形成します。アデニン (A) はチミン (T) とペアになり、シトシン (C) はグアニン (G) とペアになります。このペアリングは、細胞分裂が発生したときに DNA の分子が複製される方法の基本です。ペアリングは、DNA シーケンスに関連するほとんどの実験が実行される方法の基本でもあります。ヒトゲノムは、人間の形態を作成および維持するための指示を出す数十億の塩基対を持っています.
今日では、適切な機器と材料があれば、DNA シーケンス チャートの短いチャンクのシーケンスが可能になりました。しかし、ゲノム全体 (生物のすべての DNA) を解読することは依然として困難な作業です。これには、ゲノムの DNA 配列チャートを多数の小さな断片に分割し、断片を配列決定し、配列を 1 つの長い「コンセンサス」に配置することが含まれます。過去数十年にわたって開発された最新の方法のおかげで、ゲノム配列決定は現在、ヒトゲノム プロジェクトの時代よりもはるかに迅速かつ低コストです。
このディスカッションでは、DNA シーケンスに使用される方法を見ていきます。信頼できる方法の 1 つであるサンガー シーケンスに焦点を当てますが、コストを削減し、大規模な DNA シーケンスの速度を加速した新しい (「次世代」) 方法についても説明します。
サンガー法:連鎖法の終焉
サンガー配列決定は、約 900 塩基対の DNA 配列表の断片を配列決定するために日常的に使用される DNA 配列決定の手法です。これは連鎖停止法とも呼ばれ、1977 年に英国の科学者フレッド・サンガーとそのパートナーによって開発されました。
サンガー配列決定法は、ヒトゲノムのプロジェクトでヒトの DNA のいくつかの小さな断片の配列を見つけるために採用されました。これらのフラグメントは、必ずしも 900 塩基対以下ではありませんでしたが、科学者は、複数回のサンガー シーケンスを使用して各フラグメントを解読できました。 DNA の部分は、一致する部分に従って並べられ、DNA の大部分の配列が解読され、最終的には染色体全体が解読されました。
現在、ゲノムは一般に他のより高速で経済的に有利な方法で配列決定されていますが、サンガー配列決定は、DNA のクローニングに使用される断片や PCR によって作成される断片など、個々の DNA 断片の配列決定に広く使用されています。
サンガー シーケンスの成分
サンガー シーケンスでは、DNA のターゲット領域の無数のレプリカを作成する必要があります。インビトロで DNA を複製する PCR での DNA 複製に必要な成分と同じ成分が含まれています。それらには以下が含まれます:
- DNA ポリメラーゼと呼ばれる酵素
- プライマーは、テンプレート DNA と結合する一本鎖 DNA の短い断片であり、ポリメラーゼの初心者のように機能します。
- 4 つの DNA ヌクレオチド
- 配列決定が必要な DNA
- サンガー配列決定の反応も特定の成分で構成されます。ジデオキシは、それぞれが異なる色の色素で標識された 4 つのヌクレオチドのバージョンです。
これらのヌクレオチドは通常のヌクレオチドに似ていますが、主な違いが 1 つあります。それは、糖環の 3' 末端の炭素にヒドロキシル基がないことです。通常のヌクレオチドでは、3' 末端のヒドロキシル基が「フック」として機能し、既存の鎖に追加する必要がある新しいヌクレオチドへのアクセスを許可します。
ジデオキシ ヌクレオチドが鎖に付加された後は、ヒドロキシルが利用できず、それ以上ヌクレオチドを付加することはできません。鎖はジデオキシ ヌクレオチドで終わり、運ぶ塩基 (A、T、C、または G) に基づいて特定の色の染料でマークされます。
サンガー法
シーケンシングされる DNA のサンプルは、チューブ内でプライマー、DNA ポリメラーゼ、およびヌクレオチドと混合されます。 4 つの色素標識鎖終結ジデオキシ ヌクレオチドも結合しますが、通常のヌクレオチドよりも少量です。
まず、混合物を高温にさらして、テンプレート DNA 配列を変性させ、鎖を切り離します。次に、プライマーが一本鎖テンプレートと結合できるように温度を下げます。プライマーが結合した後、再び温度を上げて、DNA ポリメラーゼがプライマーから始まる新しい DNA を生成できるようにします。 DNA ポリメラーゼは、通常のヌクレオチドの代わりにジデオキシヌクレオチドが付加されるまで、鎖にヌクレオチドを付加し続けます。その後、さらにヌクレオチドを追加することはできず、鎖はジデオキシ ヌクレオチドで完成します。
このプロセスは、数サイクルで何度も繰り返されます。サイクリングが完了すると、ジデオキシヌクレオチドが少なくとも1回の反応で標的相補的DNA配列のすべての位置に結合されていることが実質的に保証されます。つまり、チューブには異なる長さのフラグメントがあり、元の相補的 DNA 配列の各ヌクレオチド位置で閉じます。断片の末端は、最終ヌクレオチドを指定する色素で標識されます。
次世代シーケンス
名前がスタートレックのように聞こえると思っているなら、それが呼ばれるものです!最新の DNA 配列決定技術セットは、まとめて次世代配列決定と呼ばれます。
さまざまなテクノロジーを使用したさまざまな次世代シーケンス技術が利用可能です。ただし、それらのほとんどには、サンガー シーケンスとは異なる共通の特徴があります。
ほぼ平行 :シーケンスの複数の反応が同時に発生します
マイクロスケール :反応は小さく、チップ上で一度に多くの反応を行うことができます
高速 :反応は並行して実行されるため、結果ははるかに迅速に準備されます
低コスト :ゲノムの配列決定は、サンガー配列決定よりも安価です
短め :通常、読み取り範囲は 50 ～ 700 です
長さのヌクレオチド
開発中の新しい配列決定技術はありますか?
新しい配列決定技術の 1 つは、非常に高速で効率的なムービー カメラと顕微鏡を使用して、DNA ポリメラーゼ分子が DNA (細胞内で新しい DNA コピーを作成するのと同じ分子) を複製する様子を観察し、文字ごとに 1 つずつ、異なる色の異なる明るい色素を統合することです。 A、T、C、および G。この方法は、最も一般的に使用されている計器システムによって提供されるものとは異なる、非常に役立つ情報を提供します。
開発中のもう 1 つの最新技術は、DNA 配列決定にナノポアを使用することです。これには、非常に小さな膜状の細孔を介して DNA シーケンサーの一本鎖を通すことが含まれます。相補的な DNA 配列の塩基は、ナノポアを圧縮する際に一度に 1 つずつ通り抜けます。塩基は、イオンへの影響と細孔を介して流れる電流の違いを推定することによって指摘されます。 DNA配列決定を利用するDNAプロファイルにナノポアを使用すると、現在の技術よりも多くの潜在的な利点が得られます。目標は、シーケンシングのコストを削減し、より迅速に実行することです。現在の配列決定方法とは異なり、ナノポア DNA プロファイルは DNA 配列決定を利用して、研究者が同じ分子を繰り返し研究できるようにします。
結論
診療所で DNA シーケンシングを利用したルーチンの DNA プロファイルはまだ夢のような話ですが、一部の大規模な医療センターではシーケンシングを使用して病状の診断と治療を開始しています。たとえば、がんの場合、医師はシーケンシング データを徐々に使用して、患者の特定のがんの種類を特定しています。これにより、医師はより良い治療法を選択することができます。酵母やチンパンジーなど、さまざまな種類の動物や生物のゲノム配列を区別することで、発生と進化の生物学への洞察も得ることができます。
よくある質問
<強い>1. DNA シーケンシングはどのくらい新しいものですか?
ヒトゲノム計画の実行後、技術の進歩により速度が向上し、個々の遺伝子を日常的に配列決定できるレベルまでコストが削減されました。一部のラボでは、年間 100 兆をはるかに超える塩基の配列決定が可能であり、数千ドルで完全なゲノムの配列を決定できます。
<強い>2.人間の健康に対する DNA 配列決定の重要性は何ですか?
研究者は現在、100 万塩基以上の大規模な DNA シーケンサー ストレッチを個々の個体からより迅速かつ安価に区別できるようになりました。このような比較は、病状への感受性と環境要因への反応における遺伝の役割に関する膨大な量の情報を提供できます。さらに、ゲノムをより速く、費用対効果の高い方法で配列決定する能力は、診断と治療に大きな可能性をもたらします。
<強い>3.サンガー シーケンスの用途と制限事項は何ですか?
サンガー シーケンスは、比較的長い DNA ストレッチ (約 900 塩基対まで) に対して高品質のシーケンスを示します。一般に、バクテリアのプラスミドや PCR で複製された DNA など、個々の DNA シーケンサー断片のシーケンスに使用されます。
ただし、サンガー シーケンスの制限は、高価であり、大規模なプロジェクト、たとえば全ゲノムまたはメタゲノムのシーケンスには効果がないことです。最新の大規模シーケンシング技術は、そのようなタスクをより迅速かつ安価に処理できます。
