配列決定は、特定の DNA 断片のヌクレオチド配列の決定に関与するプロセスです。シーケンス中に、DNA フラグメントは PCR によって蛍光標識ヌクレオチドで末端標識されます。このプロセスでは、4 種類の蛍光標識ヌクレオチドが使用され、それらはジデオキシヌクレオチド (ddNTP) です。 ddNTP には、入ってくるヌクレオチドのリン酸基が結合する 3' OH 基がありません。したがって、成長中の鎖に ddNTP が付加されると、鎖の 3' 末端にヌクレオチドがさらに付加されることはありません。つまり、成長するチェーンに ddNTP を追加すると、チェーンの成長が停止します。 ddNTP は低濃度で PCR 混合物に添加されるため、成長する各鎖は異なるレベルで終了します。発光する蛍光を検出して、PCR の最後に DNA フラグメントのヌクレオチド配列を決定します。
対象となる主な分野
1. DNAシーケンシングとは
– 定義、タイプ
2. DNA 配列決定の仕組み
– DNA 配列決定のプロセス
重要な用語:ジデオキシヌクレオチド (ddNTP)、蛍光マーカー、ゲル電気泳動、次世代シーケンス、ヌクレオチド シーケンス、PCR、サンガー シーケンス
DNA 配列決定とは
DNA 配列決定は、特定の DNA 分子のヌクレオチド配列の決定に使用される実験技術です。 PCR 中に取り込まれる蛍光標識ヌクレオチドを使用します。蛍光の検出に使用される技術に基づくシーケンシングには、主に 2 つの方法があります。サンガー シーケンシングと次世代シーケンシングです。
サンガー配列決定
1975 年に Fredric Sanger によって開発されたサンガー配列決定法は、最初に開発された配列決定法です。 チェーン ターミネーション法とも呼ばれます。 以来 in vitro 中の鎖末端 ddNTP の選択的取り込みに関与しています。 DNA合成。サンガー シーケンスでは、アンプリコンはゲル電気泳動によって分離されます。サンガー配列決定は、クローニングに使用される DNA 断片および PCR によって増幅された断片の配列決定に広く使用されています。決定された DNA 配列は 図 1 に示されています。
図 1:DNA 配列決定
次世代シーケンス
最新の DNA 配列決定技術は、総称して次世代配列決定と呼ばれています。チェーンターミネーション方式でもあります。次世代シーケンシングでは、キャピラリー電気泳動を使用して、チェーン ターミネーション法によって作成されたさまざまな長さのアンプリコンを分離します。次世代シーケンスは、ゲノム シーケンスなど、1 回の実行で多数のヌクレオチドを決定する場合に使用されます。
DNA 配列決定の仕組み
DNA シーケンシング中に、蛍光標識されたヌクレオチドが PCR によって特定の DNA フラグメントに付加されます。 DNA 鎖の伸長には、通常のデオキシヌクレオチド (dNTP) が使用されます。ただし、ddNTPs は、蛍光標識された反応混合物に追加されます。 ddNTP はデオキシリボース糖分子に 3' OH 基を持たないため、それ以上の鎖の成長は起こらず、鎖の成長は停止します。 DNAの糖-リン酸骨格は、デオキシリボース糖の3'OH基と入ってくるヌクレオチドのリン酸基との間のホスホジエステル結合の形成によって形成されます。ただし、ddNTP は低濃度で添加されます。したがって、チェーンの成長をすぐに終了させることはありません。
4 種類の ddNTP が 4 つの別々の PCR 混合物に追加されます。 ddATP、ddGTP、ddCTP、および ddTTP を添加することにより、4 つの別々の PCR 反応が実行されます。したがって、各反応混合物では、鎖の成長はそれぞれ A、G、C、および T ヌクレオチドで終了します。例として、ddATP を添加した反応混合物では、異なるアンプリコンの成長は DNA フラグメントの各 A ヌクレオチドで停止します。サンガー配列決定による DNA 配列の決定は 図 2 に示されています .
図 2:サンガー シーケンス
4 種類のヌクレオチドはそれぞれ、別々の蛍光色で標識されています。 ddATP は緑色の色素で標識されています。 ddGTP は黄色の色素で標識されています。 ddCTP は青色でラベル付けされています。 ddTTP は赤い色素で標識されています .したがって、4 つの PCR 反応のアンプリコンは別々の色でラベル付けされます。
目的の DNA フラグメントを増幅した後、アンプリコンをゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動で分離します。放出された蛍光を検出することにより、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。 750 ～ 1,000 塩基対の長さのフラグメントのヌクレオチド シーケンスは、サンガー シーケンスによって実行ごとに簡単に決定できます。しかし、ゲノムには多数のヌクレオチドが存在するため、全ゲノムのヌクレオチド配列の決定は依然として困難です。ただし、454 シーケンシングなどの次世代シーケンシング技術では、1 回の実行で約 2,000 万塩基対を読み取ることができます。
結論
DNA 配列決定は、DNA 断片のヌクレオチド配列の決定に使用される分子生物学的手法です。シーケンス中に、蛍光標識ヌクレオチドが PCR によって DNA フラグメントに追加されます。発光する蛍光を検出することにより、塩基配列を決定することができます。
参照:
1.「DNA配列決定」。 カーン アカデミー 、ここから入手できます。
画像提供:
1. Sjef による「DNA 配列」 – 自作、パブリック ドメイン)、コモンズ ウィキメディア経由BY-SA 3.0) コモンズ ウィキメディア経由
