免疫ブロットとウエスタンブロットの違いについては、免疫ブロットは、サンプル中に存在する特定のタンパク質を検出するための分子生物学および免疫遺伝学の技術であるウエスタンブロットのより正確な名前です。 .抗体はウエスタンブロットのプロセスに参加するため、より正確にはイムノブロットと呼ばれることがあります。したがって、イムノブロットとウエスタンブロットの間に原理、方法論、またはアプリケーションに大きな違いはありません。
基本的に、ウェスタンブロットでは、タンパク質はゲル電気泳動によって変性およびサイズ分離されます。その後、分離されたタンパク質バンドは、ブロッティングとして知られるプロセスで、ニトロセルロースや PVDF などの担体膜に転写されます。最終的に、蛍光標識、放射性標識、またはレポーター酵素と結合した抗体は、膜上の特定のタンパク質の認識に関与します。
対象となる主な分野
1. 免疫ブロットとは
– 簡単な説明
2. イムノブロットの方法論とは
– タンパク質の均等ローディング、タンパク質の分離、電気泳動移動、抗体プロービング
3. イムノブロットの用途とは
– 生化学、臨床応用
4. ウエスタンブロットとは
– 簡単な説明
主な用語
タンパク質の検出、免疫ブロット、一次抗体、二次抗体、ウエスタンブロット
免疫ブロットとは
免疫ブロットは、サンプル中の特定のタンパク質を検出するために、分子生物学および免疫遺伝学で最もよく使用される手法です。一般に、この手法は、タンパク質の検出にアンチを使用するため、より具体的に「免疫ブロット」と呼ばれています。
図 1:免疫ブロット
さらに、スイスのバーゼルにあるフリードリッヒ ミーシャー研究所のハリー トウビンの研究室がこの方法を開発しました。ここで、イムノブロットの原理には、タンパク質の均等な負荷、分子量によるタンパク質の分離、適切な膜へのタンパク質の電気泳動転写、および抗体のプロービングが含まれます。
免疫ブロットの方法論
タンパク質の均等負荷
通常、イムノブロットの各サンプルのタンパク質濃度を等しくすることが重要です。基本的に、各サンプルの 3 つのコンポーネントは、タンパク質抽出物、細胞溶解バッファー、およびサンプル バッファーです。ここで、細胞溶解バッファーは、タンパク質抽出物を目的のタンパク質濃度に正規化するために重要です。さらに、サンプル バッファーまたは Laemmli バッファーは、イムノブロットのサンプル調製に固有のものです。これには、SDS-PAGE で機能する試薬が含まれています。また、Tris-HCl pH 6.80 グリセロール、SDS、ベータ-メルカプトエタノール、ブロモフェノール ブルーが含まれています。
Tris-HCl pH 6.80 は、不連続バッファー システムと結合して機能します。また、グリセロールはロード中にサンプルに密度を加えます。これらに加えて、SDS は強力なイオン性界面活性剤であり、変性タンパク質を等しい陰イオン対質量比でコーティングします。したがって、これはタンパク質の電荷、サイズ、および形状をマスクし、分子量の関数としてタンパク質の分離を可能にします。一方、β-メルカプトエタノールは、タンパク質の形状をある程度保持するジスルフィド結合を減少させます。さらに、ブロモフェノール ブルーは、ゲル電気泳動中に色素フロントとして機能します。
分子量によるタンパク質の分離
上記に続いて、SDS-PAGE により、界面活性剤と不連続バッファー システムの助けを借りて、分子量によるサンプルの分離が可能になります。一般に、サンプルはゲルにロードする前に熱変性され、モノマー分子量による分離が保証されます。また、SDS-PAGE の洗剤は SDS です。
図 2:SDS-PAGE
さらに、不連続バッファー システムには 2 つのバッファーが含まれます。ランニングバッファーと電極バッファー。
電気泳動転写
通常、ブロッティングには複数の方法があり、異なるメンブレンへのタンパク質の電気泳動転写が含まれます。ただし、それらの原理は似ており、負に帯電したサンプルが陽極に向かって移動します。
図 3:電気泳動転写
このプロセスでは、PVDF メンブレンが登場するまで、ニトロセルロースがメンブレンとしてのゴールド スタンダードでした。重要なことに、これらの膜は、前者に対してより高いタンパク質結合能力を持っています。
抗体プローブ
最終的に、2 種類の抗体がプローブと分析に関与します。それらは一次抗体と二次抗体です。今、タンパク質は膜の上にあります。したがって、一次抗体は膜上のタンパク質の特定の領域に直接結合します。一方、二次抗体は一次抗体を介して特定のタンパク質に間接的に結合します。重要なことに、ブロッキングは、抗体プロービングの前にメンブレンの残りの表面領域をコーティングする手順です。したがって、これによりバックグラウンドが減少し、誤検知が排除されます。また、ブロッキングバッファーにはカゼインまたはウシ血清アルブミン (BSA) が含まれています。すべてがサンプルタンパク質に対して低い親和性を持っています。さらに、2 種類の抗体のそれぞれとメンブレンをインキュベーションした後の洗浄ステップも、バックグラウンドを低減するために重要です。
図 4:抗体プローブ
さらに、二次抗体は通常、分析のために特定の成分と結合します。ここで、この成分は、放射性同位元素、フルオロフォア、またはより一般的には西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ（AP）などのレポーター酵素のいずれかです。重要なことに、化学発光法での分析で酵素を使用すると、比色分析によって膜に結合した抗体を検出できます。
図 5:化学発光検出
最後に、メンブレン上のバンドの可視化により、使用した一次抗体に対する特定のタンパク質の存在が確認されます。
アプリケーション
通常、生化学では、免疫ブロットは単一タンパク質またはタンパク質修飾の定性的検出に非常に重要です。また、バンドのサイズと色の濃さは、半定性分析を提供します。したがって、免疫ブロットは、クローニング後のタンパク質産生の検証において重要です。
臨床的に、イムノブロットは血清および尿中の抗 HIV 抗体の検出において重要な役割を果たします。通常、ELISA 検査の後に HIV の診断を確認することが重要ですが、これは偽陽性を与える可能性があります。また、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症、狂牛病、ライム病などの検出にも重要です。
ウェスタン ブロットとは
「ウエスタンブロット」は、サンプル中の特定のタンパク質を検出する免疫ブロットの別名です。ただし、「ウェスタン ブロット」という用語は、1981 年に W. ニール バーネット によって、DNA の同名のサザン ブロットにちなんで造られました。一方、サザンブロットは英国の生物学者エドウィン・サザンによって開発され、メンブレンブロット上の特定の DNA 配列を検出しました。また、「ノーザンブロット」は、1977 年にスタンフォード大学の James Alwine、 David Kemp、および George Stark によって Gerhard Heinrich の貢献により開発された RNA 検出技術です。
Immunoblot と Western Blot の違い
- イムノブロットとウエスタンブロット法。ただし、免疫ブロットは、サンプル中のタンパク質の検出に抗体を使用するため、この技術のより正しい名前です。
結論
免疫ブロットは、抗体を使用してサンプル中の特定のタンパク質を検出する分子生物学の手法です。したがって、検出目的で抗体を使用するため、この技術のより正確な名前はイムノブロットです。ただし、反対の手法であるサザンブロットを表すために、「ウエスタンブロット」としても知られています。これは、ブロットで特定の DNA 配列を検出します。プロセスに関して、イムノブロットは、ゲル上で変性タンパク質をサイズ分離し、その後、得られたフラグメントをメンブレンに転写します。最後に、標識抗体が膜上の特定のタンパク質に結合します。したがって、この説明に基づいて、原理、方法論、またはアプリケーションに関して、免疫ブロットとウエスタンブロットの間に大きな違いはありません。
参考文献:
1. Gavini K, Parameshwaran K. Western Blot (Protein Immunoblot) [2019 年 6 月 7 日更新]。 In:StatPearls [インターネット].トレジャー アイランド (フロリダ州):StatPearls パブリッシング。 2019年1月～ここから入手できます。
画像提供:
1. 「抗リポ酸免疫ブロット」TimVickers – Commons Wikimedia 経由の自作 (CC BY-SA 3.0)
2. 「SDS-PAGE 電気泳動」Bensaccount による英語版ウィキペディア (CC BY 3.0)、Commons Wikimedia 経由
3. 「ウェスタン ブロット トランスファー」英語版ウィキペディアの Bensaccount による (CC BY 3.0)、Commons Wikimedia 経由
4. 「ウェスタン ブロット バインディング」英語版ウィキペディアの Bensaccount による (CC BY 3.0)、Commons Wikimedia 経由
5. 「ウエスタンブロット化学発光検出」英語版ウィキペディアの Bensaccount による (CC BY 3.0)、Commons Wikimedia 経由
