コア コンセプト
この記事では、分子クローニングと呼ばれる DNA 増幅の基本的な手法について学びます。この手順の背後にある生化学と、いくつかの重要なアプリケーションについて見ていきましょう。
DNA の研究
生物学と生化学のさまざまな分野で、DNA の分析は生物システムを理解する上で重要な役割を果たします。ただし、DNA 配列は、ゲルの実行や光吸収の測定などの方法を使用して、実際には高濃度でしか分析できません。これは、特定の遺伝子または配列に関心のある科学者にとって困難をもたらします。結局のところ、人間の遺伝子は通常、細胞内にせいぜい一握りのコピーしか持っていません。このような低濃度では、関心のある科学者にほとんど配列情報が得られません。
このように、DNA が科学者にとって関心のある分子になって以来、大量の DNA 配列を複製して生成する技術は依然として重要です。実際、DNA 増幅プロセスには、遺伝子組み換え、工業用医薬品の製造、病原体検査、遺伝子スクリーニング、DNA フィンガープリンティングなど、さまざまな重要な用途があります。
これらの各アプリケーションがどのように実行されるかを理解するために、最も重要な増幅技術の 1 つである分子クローニングを見てみましょう。別の重要なテクニックについて知りたい場合は、PCR に関する記事をご覧ください。
分子クローニング
分子クローニングは、細菌が自然に行う DNA 複製を利用します。具体的には、目的の配列を生きた細菌細胞に配置し、それらを複数回複製できるようにすることを含みます。これにより、それぞれが目的の DNA 配列を持つ何百万もの細菌が生まれる可能性があります。
生きた細菌株 (通常は 大腸菌 )、分子クローニングを効果的に使用するには、2 つの重要なコンポーネントが必要です:
- クローニングベクター
- 制限エンドヌクレアーゼ
クローニングベクターは、複製したい配列を運ぶ短い DNA です。自然界では、細菌は形質導入と呼ばれるプロセスを通じて、プラスミドと呼ばれる DNA の小さな断片を取り込みます。これには、細菌の膜と細胞壁を通過する DNA 輸送が含まれます。中に入ると、バクテリアはプラスミド上で遺伝子を発現し、プラスミドを複製して娘細胞に渡すことができます.多くの場合、クローニングベクターには、配列の形質導入に成功した細菌を選択するのに役立つ抗生物質耐性遺伝子が含まれています。
制限エンドヌクレアーゼは、特定の配列で DNA を切断する酵素です。制限酵素が結合して切断する特定の配列は、その「認識部位」と呼ばれます。興味深いことに、これらの酵素は 2 本の DNA 鎖を異なる点で切断し、不対ヌクレオチドの短いストレッチを作成します。生化学者は、これらの対になっていないストレッチを「粘着末端」と呼んでいます。なぜなら、それらは相補的な配列と容易に塩基対を形成するからです。
これらの成分がどのように DNA 増幅を可能にするかを理解するには、分子クローニングのステップを詳しく調べる必要があります.
最初のステップ:DNA 配列の挿入
分子クローニングを使用して効果的に DNA を増幅するには、最初のステップで目的の配列をクローニング ベクターに挿入します。これを行うには、選択したエンドヌクレアーゼの認識部位を含むクローニング ベクターを選択する必要があります。また、目的の配列と、その配列の上流と下流にある 2 つの同じ認識部位を含む、非常に短い DNA 二本鎖を設計する必要があります。したがって、制限酵素がクローニングベクターと目的の配列を切断すると、粘着末端が塩基対を形成します。次に、DNA リガーゼは、ベクターの鎖と配列を結合する反応を触媒します。
第 2 ステップ:プラスミドを細菌に導入する
次に、作成したばかりのベクター配列プラスミドを細菌細胞が取り込む必要があります。通常、形質転換の効率は低くなります。細菌が外来プラスミドを自然に取り込むことはめったにありません。バクテリアがプラスミドを取り込む可能性を高めるために、「ヒートショック」を実行できます。これには、バクテリア培養を長期間低温に保ち、その後急速に温度を上げることが含まれます.実際には、効果的なヒートショックは、バクテリアのチューブをしばらく氷の上に置いた後、温かいお湯にすばやく浸すことです.熱ショックは細菌細胞壁の透過性を高め、形質導入効率を高めます。それでも、熱ショックがあっても、培養物中の比較的少数の細菌が容易に形質導入を行います.
第 3 ステップ:目的の細菌を分離する
第三に、プラスミドを持つ細菌を持たない細菌から分離する必要があります。ここで、クローニングベクター上の抗生物質耐性遺伝子が活躍します。通常、液体細菌培養物は、抗生物質と栄養素を含むプレート全体に広げられます。これにより、プラスミドを持つバクテリアは生き残り、成長することができますが、プラスミドを持たないバクテリアは生き残れません.
第 4 ステップ:DNA 配列の収集
第 4 に、耐性菌を増殖させ、そのプラスミドを収穫する必要があります。 1 つの方法では、ピペット チップを使用して、プラスミドが含まれているはずの抗生物質プレートに細菌のコロニーを突き刺し、チップを栄養ブロスに入れます。これにより、プラスミドを持つ細菌の数が大幅に増加し、透明なブロスが濁ります。次に、アルカリ条件下で細菌を溶解し、遠心分離とカラムクロマトグラフィーでプラスミドを精製できます。これにより、バクテリアから離れた目的のフラグメントが濃縮されます。
分子クローニングの応用
植物の遺伝子組み換え
分子クローニングの最も影響力のあるアプリケーションの 1 つは、農業における遺伝子組み換え生物の開発に関するものです。バイオテクノロジーの進歩に伴い、農業業界は作物の遺伝子組み換えに多額の投資を行って、品質を向上させ、収量を増やしてきました。これらの遺伝子組み換え作物は、多くの場合、害虫や雑草を殺すための除草剤に対して遺伝的耐性を持っています.
植物を遺伝子操作するために、農業科学者は細菌種 Agrobacterium tumafaciens を使用します。 既知の植物病原体。自然界では、A. tumafaciens はそのプラスミドを植物組織に移植し、プラスミドの T-DNA 領域によって引き起こされる腫瘍の形成を誘導します。分子クローニングを使用して、科学者は、T-DNA 領域が異なる遺伝子に置き換えられたこのプラスミドのバージョンを構築および増幅できます。これにより、農業産業に有利な遺伝子が植物組織に導入されます。
タンパク質の生産
分子クローニングのもう 1 つの重要なアプリケーションには、医薬品に使用されるタンパク質の大量生産が含まれます。そのような場合、クローニングベクターに移植された配列は、治療上の価値のあるタンパク質の遺伝子を含む。細菌に形質導入されると、細菌の分子機構が遺伝子を転写および翻訳し、目的のタンパク質を合成します。複数世代にわたってクローン化すると、大量のタンパク質を生産できます。
糖尿病患者にとって重要な薬であるインスリンは、科学者が分子クローニングを使用して作成できるタンパク質の 1 つです。
