コア コンセプト
この記事では、PCR としてよく知られているポリメラーゼ連鎖反応について、その歴史、詳細なメカニズム、実際の使用法など、すべてを学びます。
DNA の研究
生物学者が DNA の重要性を認識し始めて以来、DNA 配列を分離および複製する技術は、生物学研究において非常に重要でした。具体的には、そのような技術は、科学者が光吸収、ゲル電気泳動、およびその他の方法で分析できる、特定のストレッチの DNA を高濃度で生成するために必要でした。
何十年もの間、DNA のストレッチを増幅する主な方法には、生化学者が分子クローニングと呼ぶプロセスが含まれていました。しかし、この方法では、DNA の濃縮サンプルを得るのに、数週間とは言わないまでも、しばしば数日を要しました。したがって、科学者の間では、新しい技術の開発に対する需要が高いままでした。ここで、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) の出番です。
かつては時間とコストのかかるプロセスであったプロセスが、すぐに効率的でシンプルになり、信頼できるものになりました。 PCR を使用して、科学者は、DNA フィンガープリンティング、父子鑑定、ウイルス感染検査など、DNA に関連する多くの新しいアプリケーションを開発しました。
今日ではその重要性から、質問することは依然として価値があります:PCR とは正確には何ですか? PCR がどのように科学に革命をもたらしたかを理解するには、もっと詳しく調べる必要があります。
PCR とは?
分子クローニングと同様に、PCR には 2 つの重要な要素が必要です:
- DNA プライマー
- Taq DNA ポリメラーゼ
ただし、分子クローニングとは異なり、PCR は細菌株や生きた生物を必要としません。代わりに、DNA は純粋な化学的手段によって増幅されます。
重要なのは、複製したい配列に関する情報を知っておく必要があるということです。目的の配列の直前と直後の小さな範囲の塩基を知っておく必要があります。 PCR が機能するには、これらのストレッチに対応する一本鎖 DNA (ssDNA) の短いシーケンスを設計する必要があります。生化学者はこれらのストレッチを「プライマー」と呼び、そのうちの 2 つが必要です。1 つは目的の配列の前の DNA と塩基対を形成し、もう 1 つは目的の配列の後の相補的 DNA と塩基対を形成します。したがって、2 番目のプライマーは、もう一方の鎖の目的の配列の後に DNA に結合します。
DNA プライマーに加えて、Taq DNA ポリメラーゼと呼ばれる特別な酵素も必要です。すべての生物は、プライマーを使用して DNA 鎖を組み立てる何らかの形の DNA ポリメラーゼを持っています。しかし、Taq DNA Polymerase の起源は、イエローストーンの火山地帯に生息する微生物の一種です。したがって、この形態の DNA ポリメラーゼは高温で機能するように独自に適合されており、より迅速な重合が可能になります。さらに、ほとんどの DNA ポリメラーゼとは異なり、Taq 品種は高温で変性しません。
DNA プライマーと Taq DNA Polymerase の両方が必要な配列とともに、遊離のヌクレオチド三リン酸溶液に含まれていれば、PCR を行うことができます。反応混合物は 3 つの異なる温度段階を通過する必要があり、このサイクルを複数回繰り返して配列を完全に増幅します。
PCR フェーズ 1:変性
最初の段階では、反応混合物の温度が十分に高くなり、目的の配列を持つ DNA が「変性」または「融解」します。これは単純に、2 つのストランドが分離することを意味します。この段階では、目的の配列がより大きな DNA 鎖に埋め込まれていることに注意してください。これは染色体全体と同じくらいの大きさになる可能性がありますが、細菌のプラスミドである方がはるかに一般的です.
PCR フェーズ 2:アニーリング
第 2 段階では、反応混合物の温度が下がり、「アニーリング」が発生します。これには、それぞれの配列への DNA プライマーの結合が含まれます。プライマーは鎖よりもはるかに短いため、長い鎖はそれ自体よりもはるかに速くプライマーに結合します。
PCR フェーズ 3:延長
第 3 段階では、温度がゆっくりと上昇し、Taq DNA ポリメラーゼがプライマーに結合できるようになります。次に、酵素は自由に浮遊するヌクレオチド三リン酸を動員し、相補的な DNA 鎖と塩基対を形成し、鎖の長さに沿ってプライマーを伸長させます。すべての DNA ポリメラーゼは 5' から 3' 方向にのみ DNA 複製を実行できるため、複製された DNA には常に目的の配列自体またはその相補体が含まれます。親 DNA の二本鎖ごとに、このステップはプライマーで始まるわずかに短い DNA の 2 本の一本鎖を形成します。
PCR フェーズ 4:繰り返し
これらの同じ 3 つの温度フェーズは、目的のシーケンスを増幅するために数十回から数百回繰り返されます。 2 番目のサイクルが始まると、前のサイクルで形成されたわずかに短い DNA が、それを生成した反対側のプライマーに結合します。ポリメラーゼによって複製されると、得られた鎖には目的の配列 (またはその相補体) とプライマーに対応する短い配列が含まれます。
後のサイクルでは、この短い配列への後続のすべてのプライマー結合により、同じ配列またはその相補体を使用して、同じ長さのさらなるストレッチが生成されます。もちろん、元の親 DNA でもさらに複製が行われますが、複数のサイクルを通じて、目的の配列を持つ DNA の量は、他の DNA の量よりも小さくなります。これにより、目的の配列の増幅に成功し、濃縮溶液が生成されました。
PCR の応用
日常生活における PCR の真の有用性は、特定の DNA 配列の存在を特定できることにあります。特定のサンプルが特定の DNA 配列を持っているかどうかをテストする場合は、目的の配列のセクションに対応するプライマーを設計できます。次に、そのサンプルで PCR を実行すると、発生する唯一の DNA 複製には目的の配列が含まれる必要があります。これは、Taq DNA ポリメラーゼがテンプレート鎖に結合したプライマーからしか DNA 鎖を合成できないためです。
これは抽象的に思えるかもしれませんが、ウイルス病原体の DNA 配列を知っていると想像してください。その DNA と選択的に塩基対を形成するようにプライマーを設計できます。または、容疑者の可能性がある犯罪現場からの血液サンプルがあると想像してください。容疑者の DNA からの固有の配列 (短いタンデム反復と呼ばれる) に選択的に結合するプライマーを設計できます。または、父子鑑定のコンテキストで親子関係を決定するために同様の手順を実行することもできます。
ゲル電気泳動
しかし、目的の DNA で複製が発生したかどうかは、どうすればわかりますか?完成した PCR 反応を分析するために、サンプルをアガロースゲルにロードし、ゲル電気泳動を行います。この手順では、両端に 2 つの大きな電極を備えた緩衝液にゲルを配置します。上部、サンプルの入ったウェルの近くには、負に帯電した電極 (または陽極) が存在し、反対側には正に帯電した電極 (または陰極) が存在します。
サンプルをロードして電極の電源を入れると、DNA が陰極に向かって移動し始めます。これは、DNA がそのリン酸骨格のためにほとんどの pH レベルで負の電荷を持っているためです。重要なことに、小さな DNA フラグメントは、大きなフラグメントよりも速くゲルを移動します。わずか数分 (20 分未満) 後、親鎖は基本的に同じ場所に留まり、小さな断片はウェル内を大きく移動します。 UV ライトで画像化すると、目的の DNA の小さな断片のバンドを視覚的に確認できます。
