DNA 配列決定は、特定の DNA 分子のヌクレオチド配列を決定するのに役立つ技術です。シーケンスの 2 つの方法は、サンガー シーケンスと次世代シーケンスです。両方のタイプのシーケンシング方法は、完全に自動化された最新のものです。どの DNA 鎖も、アデニン (A)、グアニン (G)、シトシン (C)、およびチミン (T) の 4 つのヌクレオチドで構成されています。 DNA フラグメントのヌクレオチドは、両方のタイプの配列決定方法で 4 つの個別の蛍光マーカーで標識されます。 蛍光マーカーまたはフルオロフォアは、光を吸収し、明確に定義された波長で放出できる分子です。蛍光マーカーは、PCR によって DNA 鎖に組み込まれます。その後、自動化された技術によってヌクレオチドの配列が決定されます。
対象となる主な分野
1.シーケンスとは
– 定義、サンガー シーケンス、次世代シーケンス
2.蛍光マーカーはヌクレオチド配列の決定にどのように役立つのか
– 配列決定手順
重要な用語:ジデオキシヌクレオチド (ddNTP)、蛍光マーカー、ゲル電気泳動、次世代シーケンシング、ヌクレオチド シーケンス、PCR、サンガー シーケンシング
シーケンシングとは
配列決定は、DNA 分子のヌクレオチド配列を決定するために使用される実験技術です。 DNA シーケンシング法には、主に 2 つのタイプがあり、サンガー シーケンシングと次世代シーケンシングとして識別できます。サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングはどちらも、ヌクレオチド配列の決定に蛍光標識ヌクレオチドを使用します。
サンガー配列決定
サンガー配列決定法は、DNA 配列決定法として最初に開発された方法です。配列決定の方法は、1975 年に Fredric Sanger によって最初に開発されました。したがって、それは Sanger 配列決定として知られています。サンガー シーケンスの方法は、チェーン ターミネーション法としても知られています。 in vitro 中の DNA ポリメラーゼによる鎖終結ジデオキシヌクレオチド (ddNTPS) の選択的取り込みに関与しているため DNA合成。 DNA 鎖の伸長は、通常のデオキシヌクレオチド (dNTP) によって達成されます。ただし、ddNTP を反応混合物に添加して、鎖の成長を停止させます。これらの ddNTP は蛍光標識されています。 4 種類の ddNTP が、4 つの別々の PCR 混合物に追加されます。したがって、ddATP、ddGTP、ddCTP、および ddTTP を追加することにより、4 つの別々の PCR 反応が実行されます。各反応混合物において、鎖の成長は、それぞれ各 A、G、C、および T ヌクレオチドで終了します。例として、ddATP を添加した反応混合物では、異なるアンプリコンの成長は DNA フラグメントの各 A ヌクレオチドで停止します。次に、これら 4 つの反応をゲル電気泳動で分離し、蛍光光度計を使用して個別の蛍光をスキャンします。サンガー配列決定は、DNA クローニングに使用される断片および PCR によって増幅された断片の配列決定に広く使用されています。決定された塩基配列は 図 1 に示されています。
図 1:DNA 配列
次世代シーケンス
最新の DNA 配列決定技術は、総称して次世代配列決定と呼ばれています。配列決定反応は、一度にチップ上でマイクロスケールで実行されます。したがって、いくつかのシーケンス反応が並行して実行されます。次世代シークエンシングでは、ゲル電気泳動に加えてキャピラリー電気泳動を用いて、チェーンターミネーション法により作製された様々な長さのアムリコンを分離します。キャピラリー電気泳動は、電気泳動移動度に基づいて分子を分離する分析分離方法です。
蛍光マーカーはヌクレオチド配列の決定にどのように役立ちますか
シーケンス中、シーケンスされる DNA は、PCR による DNA 合成のテンプレート鎖として機能します。 DNA プライマーは、DNA ポリメラーゼによる DNA 合成の開始に使用されます。通常の 4 つの塩基 (dNTP; dATP、dGTP、dCTP、dTTP) と 4 つのジデオキシヌクレオチド (ddNTP; ddATP、ddGTP、ddCTP、および ddTTP) のいずれかの低レベルの混合物が、PCR 反応の成分として追加されます。したがって、４つのｄｄＮＴＰのそれぞれを添加することによって、４つの個々のＰＣＲ反応が行われる。ジデオキシヌクレオチドには 2 つの特別な特徴があります:
<オール>ただし、チェーン ターミネーション ddNTP は低濃度で追加されます。 PCR プロセス全体を一度に終了するわけではありません。しかし、4 つの ddNTP の 1 つが成長するチェーンに組み込まれると、その特定のチェーンの成長は終了します。したがって、各 4 回の PCR 反応の終わりに、一連のアンプリコン (PCR によって得られた DNA フラグメント) が生成され、ターゲット DNA フラグメントの各ヌクレオチドで終了します。 . これらのアンプリコンはゲルで実行できます。自動 DNA シーケンサーでヌクレオチド配列を決定するために、電気泳動ゲルの定義されたポイントを通過する蛍光色素を蛍光光度計でスキャンできます。 DNAシーケンシングで得られた蛍光標識ヌクレオチド配列を図2に示します .
図 2:蛍光標識ヌクレオチド配列
一連の塩基をそれぞれ組み合わせることで、最初の DNA 断片の塩基配列を決定することができます。 750 ～ 1,000 塩基対のフラグメントのヌクレオチド シーケンスは、サンガー シーケンスによって実行ごとに簡単に決定できます。ただし、多数のヌクレオチドが存在するため、全ゲノムの配列決定は依然として困難なままです。 454 シーケンスは、1 回の実行で 2,000 万塩基対を読み取ることができる次世代シーケンスの一種です。
結論
配列決定は、特定の DNA 断片のヌクレオチド配列を決定するために使用される技術です。サンガー シーケンスと次世代シーケンスは、2 つの主要なシーケンス技術です。どちらの技術も、ヌクレオチド配列の決定に蛍光マーカーを使用します。 4 つの鎖終結ジデオキシヌクレオチドのそれぞれは、4 つの異なる蛍光色素で標識され、配列を取得するために 4 つの別々の PCR 反応で使用されます。
参照:
1. Adams、Jill U.「DNA シーケンシング テクノロジー」。 Nature News、Nature Publishing Group、こちらから入手可能。
2. Carr, Steven M. 蛍光シーケンシング、こちらから入手可能。
3.「DNA の配列決定 – 蛍光色素による自動配列決定」。 JRank の記事はこちらから入手できます。
画像提供:
1. Shaury Nash による「Alineando secuencias (2)」(CC BY-SA 2.0)、Flickr 経由
2. 英語版ウィキペディアの Abizar による「Radioactive Fluorescent Seq」(CC BY-SA 3.0)、Commons Wikimedia 経由
