プライマーは、in vivo の両方で DNA の増幅に不可欠な要素です。 および in vitro . 生体内 、酵素、DNA ポリメラーゼには、DNA 複製の開始のためのプライマーが必要です。 インビトロ 、プライマーは主にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の開始に使用されます。配列決定、クローニング、部位特異的突然変異誘発などを含むいくつかの他の技術は、プライマーを必要とします。したがって、in vitro 用のプライマーの設計 技術は非常に単純になりますが、分子生物学者にとっては挑戦的なプロセスです。したがって、この記事では、PCR と配列決定の両方のプライマー設計の基本ルールについて説明します。
対象となる主な分野
1.プライマーとは
– 定義、タイプ、役割
2.プライマーは PCR でどのように機能しますか
– DNA の特徴、PCR のプロセス
3. PCR 用プライマーの作り方
– PCR プライマー設計の基本ルール
4.シーケンシング プライマーの設計方法
– シークエンシングプライマーの特徴
重要な用語:DNA 合成、フォワード プライマー、長さ、融解温度、PCR、リバース プライマー、シーケンシング プライマー
プライマーとは
プライマーは、DNA 合成の開始点として機能する DNA または RNA の短い鎖です。 DNA 複製を触媒する酵素は、既存の 3' 末端にヌクレオチドを付加することができます。したがって、プライマーは、プライマーとして機能することにより、DNA 合成の基礎を築きます。 RNA プライマー DNAポリメラーゼによるDNA複製の開始のために細胞内で使用されます。ただし、合成 DNA プライマー 主に PCR やその他の技術による DNA の増幅に使用できます。 PCR では 2 種類のプライマーが使用され、それらはフォワード プライマーとリバース プライマーとして知られています。 PCR では、ゲノム DNA の特定の DNA 配列にフォワード プライマーとリバース プライマーを隣接させることにより、目的の DNA フラグメントを数百万コピー生成することができます。特定の DNA 配列に隣接するフォワード プライマーとリバース プライマーを 図 1 に示します。 .
図 1:フォワード プライマーとリバース プライマー
PCR におけるプライマーの働き
DNA は、2 本の鎖が結合した分子です。塩基対パターンは、両方の鎖のそれぞれに相補的です。 2 本の鎖は、相補的な窒素塩基間の水素結合によって結合されています。さらに、各ストランドには独自の方向性があります。一方の鎖は 5' から 3' の方向性を持ち、もう一方の鎖は 3' から 5' の方向性を持ちます。したがって、2 つのストランドは逆平行です。 5' から 3' 方向の鎖はセンス鎖として知られ、3' から 5' 方向の鎖はアンチセンス鎖として知られています。 2 本の鎖はそれぞれ、PCR 中に個別に合成する必要があります。
PCR の 3 つのステップは、変性、アニーリング、伸長です。変性では、95 °C に加熱して水素結合を切断することにより、DNA の 2 つの鎖が分離されます。フォワードプライマーはセンス鎖に結合し、リバースプライマーはアンチセンス鎖に結合します。プライマーのアニーリングは、温度が 95 °C から 50 ～ 60 °C に低下したときに発生します。したがって、Taq の助けを借りて、両方の鎖を同時に合成できます。 ポリメラーゼ。センス鎖とアンチセンス鎖の両方の増幅は、5' から 3' 方向に起こります。 PCR は指数関数的な反応であるため、3 つのステップが 25 ～ 35 サイクルで繰り返されます。各サイクルでフォワード プライマーとリバース プライマーの両方を使用して、目的の DNA フラグメントを約 2 コピー生成します。 PCR におけるプライマーの役割を 図 2 に示します。 .
図 2:PCR
PCR 用プライマーの作り方
ゲノム内の特定の DNA フラグメントを増幅するには、その特定の DNA フラグメントにフォワード プライマーとリバース プライマーの両方を配置する必要があります。したがって、両方のプライマーは、DNA フラグメントに隣接する配列に相補的である必要があります。 PCR プライマーの設計を成功させるための基本的なガイドラインを以下に示します。
<オール>Primer 3、Primer X、NetPrimer、DNAstrar など、プライマーの設計を容易にするための多くのオンライン ツールが利用可能です。設計されたプライマーの特異性は、 NCBI Primer-BLAST や UCSC インシリコ PCR などのツール。
図 3:Primer 3 インターフェース
Sequencing Primer の設計方法
シーケンシング プライマーは、PCR プライマーと同様に短い DNA 鎖です。ただし、PCR プライマーは特定の DNA フラグメントの増幅用に設計されていますが、シーケンシング プライマーは PCR によって増幅された DNA フラグメントのヌクレオチド配列を明らかにするために使用されます。 PCR プライマーとは異なり、ターゲット シーケンスの長さが 500 bp 未満であれば、単一のプライマーを使用してシーケンスを行うことができます。一例として、PCRのフォワードプライマーを配列決定に使用して、センス鎖のみを増幅することができます。さらに、シーケンス反応中に許容されるミスマッチの程度は、PCR よりも高くなります。一般に、PCR プライマーはターゲット配列に相補的です。ただし、一部のシーケンシング プライマーは、ターゲット シーケンスに関連していません。それらはユニバーサルプライマーとして知られています。 T7 や SP6 などのユニバーサル プライマーは、ターゲット シーケンスを運ぶベクターにアニールします。さまざまなベクターとさまざまな種類の DNA フラグメントの両方に使用できます。
結論
プライマーは、DNA 合成を開始するための PCR および配列決定で使用されます。 PCR プライマーには、フォワード プライマーとリバース プライマーの 2 種類があります。フォワードプライマーはセンス鎖にアニールし、リバースプライマーはアンチセンス鎖にアニールします。シーケンスでは、フォワードまたはリバース プライマーを使用してターゲットを増幅できます。プライマーの設計時には、プライマーの長さ、Tm、GC 含有量など、多くの要因を考慮する必要があります。特定の配列のプライマーの設計に使用できるオンライン ツールが多数あります。
参照:
1.「プライマー設計：効率的なプロセスのヒント」。 Genome Compiler Corporation、2015 年 11 月 3 日、こちらから入手可能。
2.「シーケンシングプライマーとプライマー設計」シーケンス プライマーおよびプライマー デザイン、カルガリー大学、こちらから入手可能。
画像提供:
1. Zephyris による「Primers RevComp」 – Commons Wikimedia による自作 (CC BY-SA 3.0)
2. Enzoklop による「ポリメラーゼ連鎖反応」 – Commons Wikimedia による自作 (CC BY-SA 3.0)
