ゲル電気泳動は、生物学における核酸の電荷およびサイズに基づく分離のための頼りになる技術です。この分離は、いくつかの生物学的実験の基礎となります。
科学者が DNA を扱ったり、さまざまなサンプルから DNA を抽出したり、それらを操作したり、結合したり、酵素を使用したり、小さな断片に切断したりしているという記事をよく読みます。これらすべての技術の前提条件は、DNA を正確に視覚化できることです。
科学者がどのようにして小さな DNA 分子を視覚化できるのか疑問に思ったことはありませんか?そうですね、答えは「電気泳動」です。
DNA、RNA、タンパク質などの帯電した生体分子を電気を使って分離する方法です。 Arne Tiselius は、1931 年に初めて電気泳動を使用して生体分子を分離しました。ほぼ 1 世紀が経過しましたが、電気泳動の技術は依然として重要な技術であり、複雑な生体分子を分離する唯一の方法です。
このテクニックの背後にある原理は何ですか?
「電気泳動」の背後にある主な原理は、電気を使用して、電荷とサイズに基づいて生体分子を分離することです .この分離は、「同種の電荷は互いに反発し、反対の電荷は互いに引き合う」という単純な事実に基づいています。
ほとんどの生体分子は、正または負のいずれかに帯電しています。 DNA と RNA は、その構造に存在するリン酸基のために負の電荷を持っていますが、タンパク質は、それらを構成するアミノ酸に応じて、正または負のいずれかになります。
この分離が通常アガロース (炭水化物ポリマー) でできているゼリー媒体で行われる場合、それはアガロースゲル電気泳動と呼ばれます。
ゲル電気泳動におけるゲルとは?
ゲル電気泳動におけるゲルとは、生体分子が分離されているマトリックスを指します。食品として摂取するゼラチンのように、透明でゼリーのような性質を持っています。
電気泳動に最も一般的に使用されるマトリックスは、多糖アガロースです。なぜこの手法でアガロースが使われるのか疑問に思われるかもしれませんが、それには 2 つの理由があります。一つは、網目（クロスリンク）を形成する能力です。アガロース マトリックスはふるいまたはメッシュとして機能し、生体分子はそのサイズに応じて容易に移動できます。 2 つ目の理由は、アガロースと分離する生体分子との間に反応がないことを保証する中立的な性質であり、誤った結果の可能性を最小限に抑えます。
分離がどのように行われるかを理解するために、ゲル電気泳動のセットアップを見てみましょう。
この図は、電解質 (バッファー) 溶液に配置されたカソードとアノードを備えた電気泳動システムを示しています。サンプルウェルは、分離する生物学的サンプルをロードするために使用されます。 (写真提供:M. PATTHAWEE/Shutterstock)
このシステムは、緩衝液に浸された陽極 (正電荷) と陰極 (負電荷) の 2 つの電極を備えた小さなタンクです。この緩衝液は多くの場合、電気を通すことができる電解質です。
ゲルを緩衝液に浸します。サンプルをロードできる小さなウェルがあります。サンプル ウェルは負電極の近くにあるため、電源がオンになると、負に帯電したサンプルが正電極に移動します。
アガロースの繰り返し単位は、D-ガラクトース (糖) と 3,6-アンヒドロ L-ガラクトース (修飾糖) で構成されます。 (写真提供:ウィキメディア・コモンズ)
生体分子は電荷に基づいてゲル内を移動します とサイズ .負に帯電した生体分子は正の末端に向かって移動し、その逆も同様です。
小さいフラグメントは分子量が小さいことが多く、つまり軽いことを意味します。これにより、ゲル内を素早く移動し、より長い距離をカバーできます。反対に、大きなフラグメントは分子量が大きいため、アガロースの細孔サイズが大きな分子をより速く移動させないため、ゲル内をゆっくりと移動します。
動きは、ゲルで使用されるアガロースのパーセンテージにも基づいています。低パーセンテージのアガロースゲルは、より大きな分子の迅速な移動を容易にするために、より大きなポアサイズを持っています。より小さな DNA 分子の分離には、アガロースゲルのパーセンテージが高い方が優れています。これは、ポアサイズが小さいほど分離が向上するためです。
この図は、異なるサイズの分子の混合物がアガロースゲルをどのように移動するかを示しています。最小の分子は最大の距離を移動しますが、最大の分子は移動距離が短くなります。 (写真提供:M. Tali Lavy/Shutterstock)
DNA を可視化する方法
電気泳動バッファー、アガロースゲル、または DNA サンプルを見ると、それらはすべて透明です。では、DNA をどのように可視化するのでしょうか。 DNAまたは生体分子に結合する着色染料を使用します。最も一般的に使用される DNA 結合色素は臭化エチジウム (EtBr) です。
色素は、アガロースゲルまたは装置に充填されたバッファーに添加されます。いずれにしても、DNA と接触して結合するはずです。
この色素を加えた状態で、ゲルを紫外線 (UV) にさらします。 UV 光の下では、臭化エチジウムが明るい光を放ちます。エチジウムはすでに DNA に結合しているため、ゲル上で明るく見える場所が DNA を検出できる場所です。
EtBr は発がん性があるため、EtBr の取り扱いには常に注意が必要です。注意して使用し、適切に廃棄する必要があります。
DNA は、暗い背景に対してバンドと呼ばれる明るい小さな垂直線として表示されます。各バンドは、同じサイズの DNA 分子で構成されています。無傷のバンドは良質の DNA を示します。 DNA の品質が低いか、夾雑物が含まれている場合、DNA バンドは完全ではなく、広がり、スミアと呼ばれます。
DNA のサイズまたは分子量を決定したい場合は、市販されている既知のサイズの DNA サンプルである DNA ラダーを使用できます。サンプル DNA (分子量は不明) とともに DNA ラダーをロードすると、両方の DNA サンプルが移動した距離を比較して、サンプル DNA の分子量を決定できます。
画像は、アガロースゲル電気泳動の全プロセスを示しています。サンプルは、バッファーに保持され、電源に接続されたアガロースゲルのウェルに追加されます。サンプルがゲル内を移動した後、UV 光の下で画像化され、DNA の質と量が決定されます。 (写真提供:Soleil Nordic/Shutterstock)
ゲル内の DNA 移動に影響を与える要因は?
DNA がゲル内を移動する方法には、いくつかの要因が影響します。 DNA 分子のサイズと使用するアガロースの濃度の間には反比例の関係があります。より大きな DNA はより低い濃度のアガロースを必要とし、その逆も同様です。
また、印加電圧にも依存します。サンプルは高電圧下でより速く移動しますが、DNA バンドはそのままではありません。電圧が低いと DNA の移動が遅くなりますが、バンドは明確になります。したがって、適切な DNA 分離のために時間と電圧の間で妥協する必要があるかもしれません。
EtBr の存在、アガロースの品質、使用するバッファーの pH と組成も、DNA 移動度に影響します。
最後の言葉
アガロースゲル電気泳動は、生物学研究のいくつかの分野で核酸の品質とサイズを決定するための鍵であり、おそらく唯一の技術です。過去 20 年間で、この技術の大幅な進化と発展が見られました。また、この技術が使用される可能性のある事例が拡大しました。
