プロトコル
このプロトコルは、標準として亜硝酸ナトリウムを使用して硝酸レダクターゼ活性を測定するための一般的な方法の概要を示しています。
材料：
* 植物材料： 新鮮な葉、根、または硝酸レダクターゼを含む他の組織。
* 抽出バッファー：
* 100 mm Tris-HClバッファー、pH 7.5
* 1 mm EDTA
* 10 mm DTT（dithiothreitol）
* 0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）
* 反応混合物：
* 100 mMリン酸カリウム、pH 7.5
* 10 mm硝酸ナトリウム
* 1 mm Nadh
* 亜硝酸ナトリウム標準ソリューション： 既知の濃度の標準ソリューション（例：100 ppm）を準備します。
* Griess Reagent： （特定のプロトコルの指示を参照）
* 分光光度計： 540 nmでの吸光度を測定するため。
* 遠心分離機： 細胞の破片を分離するため。
* アイスバス： 寒い気温を維持するため。
* ピペットとヒント： 正確なボリューム測定用。
手順：
1。サンプル準備：
*植物材料を収穫し、冷たい蒸留水ですばやく洗い流します。
*適切な量の組織（0.1-1 gなど）を計量し、液体窒素を伴う乳鉢と乳棒で粉砕するか、抽出バッファーでホモジナイザーを使用します。
*ホモジネートを10,000 gで4°Cで10分間遠心化して、細胞の破片を除去します。上清はあなたの酵素抽出物です。
2。硝酸レダクターゼアッセイ：
*酵素抽出物のないブランクを含む反応混合物を含む一連のチューブを、さまざまな濃度の亜硝酸ナトリウム標準のチューブを調製します。
*反応チューブに適切な量の酵素抽出物を追加します。
* NADHを追加して反応を開始します。
*特定の時間（たとえば、30分）、30°Cでチューブをインキュベートします。
* Griess Reagentを追加して反応を終了します。
3。亜硝酸産生の測定：
*色の発達を可能にするために、暗闇の中でチューブを少なくとも15分間インキュベートします。
*分光光度計を使用して、540 nmで吸光度を測定します。
*既知の濃度の亜硝酸ナトリウムを使用して標準曲線を準備します。
*標準曲線を使用して酵素抽出物によって生成される亜硝酸塩の量を計算します。
4。硝酸還元酵素活性の計算：
*新鮮な体重（FW）またはタンパク質のグラムあたり1分あたり産生される亜硝酸塩の µmolesとして硝酸レダクターゼ活性を発現 。
注：
*このプロトコルは基本的な概要であり、植物種と実験セットアップに応じて特定の変更が必要になる場合があります。
*すべてのソリューションが新鮮に準備され、適切に保管されていることを確認してください。
*正確な結果を得るには、高品質の試薬を使用します。
*酵素抽出物なしでブランクの吸光度を測定することにより、バックグラウンド吸収の制御。
*再現性を確保するために、少なくとも3回アッセイを繰り返します。
Griess Reagent：
* Griess Reagentは、亜硝酸塩を反応させることにより、紫色の染料を生成することにより、亜硝酸塩を検出するために使用されます。
*さまざまなグリース試薬を使用できるため、準備と使用については特定のプロトコルを参照してください。
代替方法：
*硝酸還元酵素活性を測定する他の方法には、硝酸塩を基質として使用するを使用することが含まれます 硝酸塩の亜硝酸塩の還元を検出します。
* 分光光度測定 NADH濃度の変化を長期にわたって直接測定するために使用できます。
解釈：
硝酸レダクターゼ活性は、硝酸塩を亜硝酸塩に減らす植物の能力の指標であり、これは窒素同化の重要なステップです。異なる組織または異なる条件下での活性を比較すると、植物の窒素代謝に関する貴重な情報が明らかになります。
詳細情報：
* 特定の植物種または条件のプロトコル修正： ガイダンスについては、関連する科学文献または連絡先の専門家を参照してください。
* トラブルシューティング： アッセイの問題が発生した場合は、トラブルシューティングガイドまたは専門家に相談してください。
このプロトコルは、標準として亜硝酸ナトリウムを使用して硝酸レダクターゼ活性を測定するための一般的なフレームワークを提供します。特定のニーズに合わせて、正確な結果を確認してください。
