ポリメラーゼ連鎖反応または PCR は、DNA 鎖の何千ものコピーを作成する方法です。ポリメラーゼ酵素の能力を利用して、実験室条件下で遺伝物質のコピーを作成します。
DNA (デオキシリボ核酸) は、生物に関する無数の研究の基礎を形成します。 DNA コードから、病気の遺伝的基盤の収集、薬の開発、法医学的検査の実施、微生物の特定などを行うことができます。
そのような研究に必要な最も基本的なものは、調査対象の大量の DNA 断片です。ただし、細胞、組織、またはその他の生物学的ソースから分離された DNA は、多くの場合、分析には十分ではありません。したがって、科学者はより多くの DNA のコピーを作成する必要があります。
ここで、「ポリメラーゼ連鎖反応」の重要な役割が明らかになります。
ポリメラーゼ連鎖反応とは?
PCR は、ポリメラーゼ酵素の能力を利用して、実験室条件下で遺伝物質のコピーを作成します。
PCR の前に、DNA のコピーは、特定の DNA フラグメントを分離し、それを生細胞のゲノムに挿入することによって作成されていました。生きた細胞は、挿入された DNA を複製しながら、自身の DNA を複製しました。この技術は、さらなる研究に十分な DNA コピーを生成するための骨の折れる、時間のかかる方法でした.
しかし、もはやそうではありません。この進歩の功績のほとんどは、1983 年に「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）を発明し、「バイオテクノロジー革命」の始まりを示した Kary Mullis に帰します。今日、PCR は小規模なラボでも非常に一般的なラボ技術であり、定期的に DNA コピーを生成するために使用されています。
PCR は、「分子フォトコピー」としてよく知られているプロセスを通じて、目的の DNA のコピーを選択的に作成できます。 PCR を使用して DNA のいくつかのコピーが合成されると、DNA は「増幅」されます。
ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は in vitro DNA ポリメラーゼを使用して目的の DNA の複数のコピーを生成する技術。 (写真提供:kozhedub_nc/Shutterstock)
PCR 反応の成分は何ですか?
PCR 反応の重要な構成要素は、テンプレート DNA、プライマー、ヌクレオチド、および耐熱性 DNA ポリメラーゼです。これらの各コンポーネントについて簡単に学びましょう。
最も単純なバクテリアから最も複雑な動物や植物までの DNA を PCR に使用できます。ただし、全 DNA (テンプレート DNA) は PCR にかけられません。プロセス中に小さなセクションのみが増幅されます。
DNA を増幅するには、プライマー (ヌクレオチドの短いストレッチ (約 20 bp)) が非常に重要です。フォワードプライマーとリバースプライマーの両方のプライマーセットが使用される。プライマーは DNA 鎖の始点と終点に結合し、DNA 鎖を増幅する必要があるポイントを知らせます。
PCR 反応に使用されるヌクレオチドは、DNA に見られる 4 つの窒素含有塩基すべての混合物です。アデニン (A)、チミン (T)、グアニン (G)、シトシン (C) です。
最後の最も重要なコンポーネントは DNA ポリメラーゼです。ポリメラーゼ酵素は、既存の鎖に相補的な方法でヌクレオチドを組み立てることにより、新しい DNA 分子を作成します。このようにして、実際には 1 本の DNA 鎖から 2 つの同一の DNA 分子を作成できます。
酵素とともに、DNA ポリメラーゼの作用に必要な補因子を反応混合物に添加する必要があります。補因子は、酵素活性に重要な金属化合物です。マグネシウムイオンは DNA ポリメラーゼの補因子です。
PCR で使用される DNA ポリメラーゼは、高温に耐えられる好熱性生物から分離された耐熱性 DNA ポリメラーゼ (Taq ポリメラーゼと呼ばれることが多い) です。
PCR 反応の構成要素には、テンプレート DNA、Taq DNA ポリメラーゼ、バッファーとしての MgCl2、ヌクレオチド塩基 (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、上流 (フォワード) プライマー、下流 (リバース) プライマー、および超純水が含まれます。 (写真提供:オスカー・ダニエル・ルナ・ラモス/Shutterstock)
PCR 反応のステップは何ですか?
PCR に必要なすべてのコンポーネントがわかったので、PCR 反応に含まれる 3 つのステップを見てみましょう。ステップは、変性、アニーリング、および伸長です。
ポリメラーゼの活性は、プライマーが結合できる一本鎖 DNA の存在に依存します。これは、DNAサンプルを94～98°
加熱すると、2 本の DNA 鎖を結合している結合が切断されます。このプロセスは変性と呼ばれます。 二本鎖 DNA 分子が 2 つの一本鎖分子に変性されるためです。一方の DNA 鎖はテンプレート鎖と呼ばれ、そのペアは相補鎖と呼ばれます。
次のステップでは、プライマーが特定の部位でテンプレート DNA に結合 (アニール) する必要があります。フォワード プライマーは、3 bp のヌクレオチド配列 ATG (開始コドン) でテンプレート DNA の開始点 (二本鎖 DNA の 1 つの鎖) に結合します。リバース プライマーは、3 bp ヌクレオチド配列 TAG、TAA、または TGA (終止コドン) で相補的 DNA (二本鎖 DNA の 2 番目の鎖) 鎖の末端に結合します。開始コドンと停止コドンの間の DNA が増幅されます。
このステップが成功するかどうかは、プライマー配列とアニーリングに選択した温度 (通常は 50 ～ 65°) によって異なります。 C.
最後の最後のステップは、72° で発生する伸長または終了です。 C、Taq ポリメラーゼの活性に最適な温度。 DNA ポリメラーゼは、DNA のプライマー結合領域を認識し、テンプレート DNA 鎖に相補的なヌクレオチドを追加します。これは、2 番目のプライマーに遭遇するまで発生します。
終結反応が成功すると、初期段階で使用された 1 つの DNA ヘリックスの代わりに 2 つの DNA ヘリックスが生成されます。 2 つの DNA ヘリックスのそれぞれで、1 つの鎖が DNA サンプルによって提供される元の鎖になります。もう一方の鎖は、PCR 中に DNA ポリメラーゼによって合成される相補鎖になります。
PCR 反応の 3 つのステップは、変性、アニーリング、および伸長または終結です。 (写真提供:Flickr)
PCR を使用した DNA 増幅の原理は何ですか?
変性、アニーリング、および重合のステップは、1 つの PCR サイクルを構成します。一般的な PCR 反応では、最適な DNA 増幅に 25 ～ 35 サイクルが必要です。
1 サイクルの終わりに、1 つの DNA テンプレートが 2 つの DNA 分子を形成します。 2 サイクルの終わりに、2 つの DNA は 4 つの DNA 分子を形成し、3 サイクルの終わりには 8 つの DNA 分子に増幅されます。 n サイクルの終わりには、元の DNA テンプレートのコピーが 2n になります。
各サイクルの後、次のサイクルのテンプレートとして機能できる DNA 分子の数は指数関数的に増加します。サイクルごとのテンプレート数のこの増加は、PCR における DNA 分子の増幅の背後にある基礎です。
PCR 技術を使用した DNA 分子の指数関数的増幅 (写真提供:Enzoklop/Wikimedia commons)
PCR の長所と短所は何ですか?
PCR 技術の主な利点は、わずか数時間で数百万から数十億の DNA コピーを生成できることです。この技術は迅速で習得が比較的容易で、基本的な実験室条件下で実行できます。
主な欠点は、技術が非常に敏感であるため、増幅に使用されるサンプルには汚染物質が含まれていない必要があることです。微量の不要な DNA でさえ、目的の DNA とともに増幅され、誤った結果をもたらす可能性があります。
別の欠点は、プライマーを設計するために DNA の配列情報が必要なことです。さらに、プライマーは DNA の間違った部位にアニーリングすることがあります。このようなプライマーの非特異的アニーリングは、DNA の間違ったフラグメントの増幅につながる可能性があります。
まれに、DNA ポリメラーゼが間違った塩基を取り込んで、目的の DNA の配列が変化し、下流のプロセスに影響を与える可能性があります。
PCR 反応を成功させるために必要なのは、純粋な遺伝物質、適切なプライマー セット、および適切なアニーリング温度だけです。
このテクノロジーはどこで使用できますか?
PCR の主な用途は、混合 DNA サンプルからの選択的な DNA 分離です。これは、感染症、遺伝病、およびいくつかの種類の癌を短期間で診断するのに役立ちます。また、科学捜査で犯罪者を特定し、親子関係をテストするためにも使用されます。
これは、分子生物学、遺伝子クローニング、組換え DNA 技術、および突然変異誘発を含むほとんどのアプリケーションの基礎を形成します。
結論
Kary Mullis によって規定された、シンプルで汎用性の高い PCR 技術の実用的な進歩は、生物学的研究を劇的に変革しました。私たちがしなければならないことは、小さなチューブで適切な濃度の PCR のすべてのコンポーネントを混合し、PCR マシン (サーモサイクラー) にロードして、数時間待つことだけです。待機期間の後、研究者は数百万から数十億 対象の DNA のコピー。すごいと思いませんか?
これが、この画期的な発見の前に使用された方法と比較して、PCR が DNA コピーを生成するための迅速で信頼性の高い技術であり続ける理由です。
