DNA 配列決定は、特定の DNA 断片のヌクレオチド配列を決定するために使用される技術です。サンガー シーケンスと次世代シーケンスは、2 種類のシーケンス方法です。蛍光マーカーを使用して、配列内の各ヌクレオチドを識別します。 PCR は、蛍光マーカーを DNA フラグメントに組み込むために使用されます。 PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) は、実験室で特定の DNA 断片の何百万ものコピーを生成するために使用される技術です。ゲル内の PCR フラグメントの分析により、DNA フラグメントのヌクレオチド配列を決定できます。
対象となる主な分野
1.シーケンスとは
– 定義、配列決定の種類 – 次世代配列決定、サンガー配列決定
2. PCR が DNA シーケンシングのプロセスで使用される理由
– PCR 中の蛍光色素の取り込み
重要な用語:ddNTP、dNTP、DNA シーケンシング、蛍光色素、次世代シーケンシング、PCR、サンガー シーケンシング
シーケンシングとは
配列決定は、DNA 分子のヌクレオチド配列を決定するために使用される実験技術です。サンガー シーケンスと次世代シーケンスは、DNA シーケンスの 2 つの主要な方法です。どちらの DNA 配列決定法も、特定の DNA 鎖のヌクレオチド配列を決定するために、PCR による DNA 鎖への蛍光マーカーの組み込みに関与しています。
サンガー配列決定
サンガー シーケンスとして知られる最初のシーケンス方法は、1975 年に Fredric Sanger によって最初に開発されました。したがって、サンガー シーケンスとして知られています。サンガー配列決定は、in vitro 中の DNA ポリメラーゼによる鎖終結ジデオキシヌクレオチド (ddNTPS) の選択的取り込みに関与しています。 DNA合成。そのため、連鎖停止法とも呼ばれます。通常のデオキシヌクレオチド (dNTP) は、DNA 鎖の伸長に使用されます。連鎖成長を停止させるために、ddNTPも反応混合物に添加します。 4 種類の ddNTP が、4 つの別々の PCR 混合物に追加されます。したがって、ddATP、ddGTP、ddCTP、および ddTTP を追加することにより、4 つの別々の PCR 反応が実行されます。各反応混合物、単一タイプの ddNTP (ddATP が追加されている場合) が追加された場合、異なるアンプリコンの成長は、DNA フラグメントの各 (A) ヌクレオチドで停止します。次に、4 つの反応をゲル電気泳動で分離します。発光蛍光は、蛍光光度計によって検出されます。サンガー配列決定は、DNA クローニングに使用される断片および PCR によって増幅された断片の配列決定に広く使用されています。サンガー シーケンスの一般的な手順を 図 1 に示します。 .
図 1:サンガー シーケンスの一般的なプロセス
次世代シーケンス
次世代シークエンシングは、最新の DNA シーケンシング技術の総称です。次世代シーケンシングでは、複数のシーケンシング反応をチップ上で一度にマイクロスケールで実行します。どちらの配列決定方法も、PCR 中にアンプリコンに取り込まれる蛍光を伴う標識ヌクレオチドを使用し、ヌクレオチド配列の決定を可能にします。次世代シーケンシングには、蛍光マーカーの連鎖停止も関与しています。ただし、サンガー シーケンスと次世代シーケンスの主な違いは、次世代シーケンスでは異なるラベルのアンプリコンを分離するためにキャピラリー電気泳動を使用することです。キャピラリー電気泳動は、電気泳動移動度に基づいて分子を分離する分析分離方法です。
DNA 配列決定のプロセスで PCR が使用される理由
シーケンス中、ヌクレオチド配列を決定するために、蛍光マーカーを DNA 鎖に組み込む必要があります。この取り込みは、PCR 中に行われます。一般に、4 種類の dNTP は、PCR 中に新たに合成される DNA 鎖に組み込まれます。この現象は、DNA シーケンスを決定する際に、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド (ddNTP) をアンプリコンに組み込むために DNA シーケンスで使用されます。
一般に、通常の 4 塩基 (dNTP; dATP、dGTP、dCTP、dTTP) の混合物が、DNA 配列決定中に PCR 反応混合物に追加されます。
さらに、4 つのジデオキシヌクレオチド (ddNTPs; ddATP、ddGTP、ddCTP、および ddTTP) の 1 つが PCR 反応の成分として低濃度で加えられます。最後に、完全な配列を決定するために 4 回の PCR 反応を行う必要があります。
図 1:決定された DNA 配列
ddNTP には 3'-OH グループがありません そこに入ってくるヌクレオチドが DNA ポリメラーゼによって付加されます。したがって、ddNTP の組み込みは、チェーンの成長を終了します。従って、４回のＰＣＲ反応のそれぞれにおいて、鎖の終結は特定の塩基で起こる。これらの ddNTP には、さまざまな蛍光色素も組み込まれています (ddATP は緑色の色素で標識されています; ddGTP は黄色の色素で標識されています。 ddCTP は青色でラベル付けされています 、および ddTTP は赤い色素でラベル付けされています ）。 蛍光色素の取り込みと連鎖停止は、PCR 中に行われます。 アンプリコンはゲル上で実行され、ヌクレオチド配列を決定するために自動シーケンサーの蛍光光度計によってゲルがスキャンされます。
結論
DNA 配列決定は、特定の DNA 断片のヌクレオチド配列を決定するために使用される実験技術です。サンガー シーケンスと次世代シーケンスでは、PCR 中にヌクレオチド シーケンスを決定するために、さまざまな蛍光色素を DNA フラグメントに組み込みます。
参照:
1. Adams、Jill U.「DNA シーケンシング テクノロジー」。 Nature News、Nature Publishing Group、こちらから入手可能。
2.「DNA の配列決定 – 蛍光色素による自動配列決定」。 JRank の記事はこちらから入手できます。
画像提供:
1. 「サンガー配列決定 – 一般」 Автор:ユーザー:フィボナチ – власна робота (CC BY-SA 1.0)、コモンズ ウィキメディア [変更] 2. 「DNA 配列」 Sjef 著 – 自身の作品 (パブリック ドメイン)、コモンズ ウィキメディア経由
