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シストセンチュウの卵懸濁液から破片を除去するための改善された方法と、卵を数えるためのコンピューター支援技術

植物に寄生する線虫は植物の根に感染し、世界中で何十億ドルもの作物の損失を引き起こしています。そのような例の 1 つは、北米で最も有害なダイズ病原体であるダイズ シストセンチュウ (SCN) です。土壌中の線虫の卵の個体群密度 (数) を知ることは、害虫の検出、監視、および効果的な管理に不可欠です。

畑に存在する卵の密度を決定するには、畑から土壌サンプルを採取し、湿式ふるいおよびデカントまたは水簸法を使用して、線虫シスト (卵で満たされた死んだ雌) を土壌から回収します。その後、線虫嚢胞が破裂し、卵サイズの破片とともにふるいにかけられた卵を放出します。伝統的に、スクロース遠心分離を使用して卵懸濁液から破片を取り除き、次に卵を染色し、顕微鏡下で視覚的に数えて、土壌サンプル中の卵の個体数密度を推定します.

問題は、従来の卵懸濁液の洗浄と計数の手順のほとんどが手作業で行われ、時間と労力がかかるため、ターンアラウンド タイムとスループットが制限されることです。特定の日に抽出および分析できる土壌サンプルの数は限られています。また、ショ糖は安価ですが、ショ糖の遠心分離では破片が完全に除去されないため、卵の数を数えるのが困難になる場合があります。また、遠心分離後にスクロース残留物が卵の表面に残る可能性があり、保存時にサンプル内の汚染真菌や細菌の増殖を促進します。自動卵計数によるより良い卵サンプル洗浄プロセスが必要でした。

スクロースの代わりに OptiPrepTM を密度勾配媒体として使用する卵サンプル洗浄プロトコルを開発しました。このために、湿式ふるい分けとデカントを使用して、土壌サンプルから卵と破片を抽出しました。次に、卵を染色して破片の中での視覚化を改善しました。卵懸濁液を OptiPrep と混合し、15 mL 試験管に入れ、840 G で 2 分間遠心分離しました。遠心分離後、ほとんどの線虫の卵はインターフェースエマルジョン層に集まり、より重い破片粒子はチューブの底に堆積しました。最高のサンプル精製を得るために、OptiPrep の適切な濃度を決定しました。

卵計数を自動化するために、精製され染色された卵サンプルをろ紙に広げ、高解像度スキャナーでスキャンしました。畳み込みオートエンコーダー ネットワークを使用した深層学習アーキテクチャーは、スキャンされた画像を検索して、サンプル内の線虫の卵を識別およびカウントします。線虫の卵を数える別の方法は、卵懸濁液をレンズレス イメージングのマイクロ流体チップに流すことによって開発されました。卵と破片がフロー チップを通過すると、通過するオブジェクトのホログラフィック ビデオが生成され、保存されました。ホログラフィック ビデオを再構築することで、ソフトウェアは線虫の卵を (染色しなくても) 認識し、サンプル内の卵の総数を数え続けることができました。

新しいサンプル洗浄およびイメージング方法の性能をテストするために、SCN がはびこっているアイオワ州のアイオワ州立大学研究農場の 2 つの畑から土壌サンプルを収集しました。土壌サンプルから抽出された卵懸濁液は、ショ糖遠心分離と新しい OptiPrep メソッドで洗浄されました。次に、卵の準備を染色し、顕微鏡下で手動でカウントするだけでなく、私たちが開発した2つの新しいイメージング方法を使用しました.サンプル中の破片の量と方法による卵数が比較されました。

サンプル洗浄に OptiPrep を使用すると、ショ糖遠心分離を使用した場合 (<40%) と比較して、卵の回収率が大幅に改善されました (> 80%)。また、両方の自動卵計数法から得られた結果は、直接顕微鏡観察による卵計数と高い相関がありました。私たちの自動卵計数方法は、サンプルの準備とローディングの間のみ、人間の介入を最小限に抑えました。ソフトウェアは、広範な卵数 (1 mL あたり 10 ~ 300 個の卵) で残りの操作を処理しました。ハードウェアのコストは、既製のコンポーネント、粘着テープ、および標準のろ紙を使用することにより、線虫学研究室で広く採用されるように意図的に低く抑えられました。


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