中心的なコンセプト
この記事では、タンパク質分離、質量分析、定量的手法、新しい手法など、プロテオミクスの主要な手法とテクノロジーを概説します。
他の記事で取り上げられているトピック
- プロテオミクス
- 質量分析と質量分析計
- タンパク質の配列決定
はじめに
プロテオミクス タンパク質の大規模研究は、生物学をシステムレベルで理解するための強力なツールです。比較的一定のままである遺伝子とは異なり、タンパク質の発現と修飾は非常に動的であり、状況に依存します。プロテオミクス技術の進歩により生物医学研究に革命が起こり、科学者は 1 回の実験で何千ものタンパク質を同定、定量、特性評価できるようになりました。
これらの方法は、疾患メカニズムの研究、バイオマーカーの発見、標的療法の開発に不可欠です。たとえば、がん研究では、プロテオミクスは、診断または予後の指標として機能する腫瘍特異的タンパク質の特定に役立ちます。医薬品開発においては、薬物標的の検証と毒性スクリーニングをサポートします。 薬物標的の検証 タンパク質が疾患に直接関与しており、薬剤の効果的な標的となり得ることを確認します。プロテオミクスは、個別化医療においてもますます重要な役割を果たしており、タンパク質プロファイルが個々の分子の特徴に基づいて治療法を決定します。
タンパク質の分離、質量分析、定量的戦略、特殊な方法などのプロテオミクス ツールを理解することは、複雑な生物学的システムを探索し、分子の洞察を現実世界の健康ソリューションに変換することを目指す研究者にとって不可欠です。
タンパク質の分離技術
タンパク質の分離は、サンプルの複雑さを軽減し、下流分析用にサンプルを準備するために、プロテオミクスにおいて不可欠です。 下流分析 分離後にタンパク質を同定、定量、または特徴付けるために使用される技術を指します。分離方法には主に 3 つのカテゴリがあります。ゲルベースの技術、クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動です。
1.ゲルベースの方法
SDS-PAGE などのゲルベースの方法 、タンパク質をサイズごとに分離します。 SDS-PAGE では、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) が均一な負電荷でタンパク質をコーティングし、ゲル マトリックスを介したサイズベースの移動を可能にします。 SDS タンパク質を変性させ、形状や電荷の違いをなくす界面活性剤です。均一な負電荷により、タンパク質のサイズのみに基づいて分離が行われます。これは、小型から中程度のタンパク質には簡単で効果的ですが、大きなタンパク質や疎水性タンパク質には困難を伴います。大きなタンパク質は緻密なゲルマトリックス中をゆっくりと移動し、疎水性タンパク質は凝集したり、SDS 結合に抵抗したりする可能性があります。
二次元ゲル電気泳動 (2D-GE ) では、この技術をさらに一歩進めて、サイズだけでなく等電点によってもタンパク質を分離します。タンパク質の等電点 (ピ ) はその荷電環境を明らかにするため、他の点では似ているタンパク質を区別するのに役立ちます。これにより、複雑な混合物の分離が向上します。ただし、時間がかかり、すべての種類のタンパク質に最適なわけではありません。
2.クロマトグラフィーとキャピラリー電気泳動
幸いなことに、クロマトグラフィーベースの方法はより柔軟性があります。クロマトグラフィーにはいくつかの種類があり、研究者はタンパク質のどのような特性を知りたいかに応じて、どの種類を使用するかを決定します。たとえばアフィニティークロマトグラフィーです。 抗体やタグ付きタンパク質など、特異的な結合相互作用を使用してタンパク質を単離します。この方法は選択性が高くなりますが、ターゲットに関する事前の知識が必要です。 イオン交換クロマトグラフィー 電荷の違いに基づいてタンパク質を分離し、混合物の分画に役立ちます。 サイズ排除クロマトグラフィー 分子サイズごとに分離し、タンパク質構造を保存しますが、同じサイズの分子の分解能は限られています。 逆相高速液体クロマトグラフィー (RP-HPLC ) 疎水性によって分離されます。これは、質量分析用のペプチドを準備するためによく使用されます。この技術については、後ほど詳しく説明します。
もう 1 つの分離手法であるキャピラリー電気泳動です。 、狭い毛細管内の電荷とサイズの比に基づいてタンパク質またはペプチドを分離します。非常に効率的で、使用するサンプル量が少なく (それによりリソースが節約され)、質量分析内でうまく機能します。ゲルやクロマトグラフィーほど一般的には使用されていませんが、高速で高分解能の分析が可能なため注目を集めています。 料金対サイズの比率 分離中に分子がどれだけ速く移動するかを決定するため、これは重要です。この動きにより、その構造、イオン化、立体構造特性についての洞察が得られます。ゲルとクロマトグラフィーは操作が簡単で、研究室で広く入手可能であり、大量のサンプルに適しているため、より一般的に使用されます。一方、キャピラリー電気泳動では、多くの場合、より特殊な機器と専門知識が必要になります。
プロテオミクスにおける質量分析
質量分析 (MS ) はプロテオミクスの中心です。これは質量対電荷に基づいてタンパク質を識別および定量します。 (分 /z ) 比率 イオン化した分子のこと。 MS は複雑なタンパク質混合物を高感度で分析できるため、大規模なプロテオーム プロファイリングに最適です。
イオン化は MS の最初のステップであり、タンパク質またはペプチドを気相イオンに変換します。 マトリックス支援レーザー脱離/イオン化 (マルディ ) レーザーを使用して、結晶マトリックスに埋め込まれたペプチドをイオン化します。処理が早く、塩分に強く、イメージングや単純な混合によく使用されます。 MALDI はほとんどの一価イオンを生成するため、複雑なサンプルのタンデム MS 分析にはあまり適していません。 エレクトロスプレー イオン化 (ESI ）液体サンプルに高電圧を印加することでイオンを生成し、帯電した液滴を形成します。 MALDI とは対照的に、ESI は多価イオンを生成します。これは大きな生体分子の分析に最適です。一般に液体クロマトグラフィーと組み合わせて使用されます。 (LC ) 複雑なペプチド混合物の分析用。 ESI と LC を併用すると感度と分離が向上し、複雑な生体サンプル中の微量ペプチドの検出が可能になります。
質量分析装置とタンデム質量分析
質量分析装置 m に基づいてイオンを分離します。 /z 価値観。それぞれに解像度、速度、精度の点で強みがあります。 飛行時間 (トーフ ) イオンが特定の距離を移動するのにかかる時間を測定します。軽いイオンは重いイオンよりもこの距離を速く移動する (TOF が短い) ため、TOF はイオンの質量と電荷についての洞察を提供します。 TOF は高スループットと MALDI に適しています。
別のタイプの質量分析計である四重極 、振動電場を介してイオンをフィルタリングし、標的 MS に役立ちます。 オービトラップ 高い分解能と質量精度を提供し、複雑なプロテオミクスに最適です。 イオントラップ イオンを捕捉し、順次排出します。 MS/MS (詳細は次に説明します) やサンプルサイズが小さい場合に役立ちますが、Orbitrap や TOF と比べて分解能が低く、質量範囲が限られています。最新の機器では、パフォーマンスを向上させるために、四重極オービトラップや Q-TOF などのアナライザーを組み合わせることがよくあります。
タンデム質量分析 (MS/MS ) には複数回の質量分析が含まれます。 MS/MS では、 ペプチド イオン (プリカーサー イオン) ) が選択され、断片化されます。断片化されたイオンを分析して、ペプチドのアミノ酸配列を推定します。一般的な断片化手法には衝突誘起解離が含まれます。 (CID ） と高エネルギー衝突解離 (HCD ）。 MS/MS は、ペプチド断片から未知のタンパク質を同定するために不可欠です。
トップダウン プロテオミクスとボトムアップ プロテオミクス
トップダウン プロテオミクス 消化せずに無傷のタンパク質を分析します。ただし翻訳後修飾は保持されます。 (PTM ) やアイソフォーム情報など、より技術的に要求が厳しいものになります。これには高解像度の機器が必要ですが、複雑さの低いサンプルに最適です。
ボトムアップ プロテオミクス MS 分析の前にタンパク質をペプチドに消化します。感度とスループットが高いため、最も広く使用されているアプローチです。ただし、PTM またはアイソフォームに関する情報が失われる可能性があります。
定量的プロテオミクス技術
定量的プロテオミクスは、サンプル間の存在量の違いを測定します。生物学的変化、病状、薬物反応を研究するために不可欠です。主な戦略としては、同位体標識、標識フリー定量、および標的定量の 3 つがあります。
同位体標識 この方法では、安定同位体をタンパク質またはペプチドに導入し、質量シフトに基づいてサンプル間の比較を可能にします。 集団シフト より重い同位体を取り込むことによって引き起こされる分子量の検出可能な変化です。 細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識 (シラック ) 細胞増殖中に「軽い」アミノ酸または「重い」アミノ酸を使用してタンパク質を標識します。軽いアミノ酸には一般的な同位体が含まれていますが、重いアミノ酸には安定した重い同位体が含まれています。標識された細胞は処理前に結合されるため、ばらつきが少なくなります。これは、異なる条件下での細胞プロテオミクスを比較するのに理想的です。たとえば、実験グループでは重いアミノ酸を使用し、対照グループでは軽いアミノ酸を使用します。 SILAC は細胞培養システムに限定されており、組織や生体液には適用できません。
同位体コード化されたアフィニティ タグ (ICAT ) 軽化学タグまたは重化学タグを持つシステイン残基をターゲットにします。標識後、タンパク質は消化され、標識ペプチドは MS 分析用に濃縮されます。この濃縮には、アフィニティークロマトグラフィーを使用してタグ付きペプチドを分離することが含まれており、サンプルの複雑性が軽減され、検出感度が向上します。 ICAT は複雑さを軽減しますが、システインのないタンパク質を見逃し、部分的なプロテオームしかカバーしません。これを補うために、相補的な技術または標識法 (次に説明する TMT や iTRAQ など) を使用すると、システインを含まないタンパク質を検出できます。これらの方法を ICAT と併用すると、より広範囲のプロテオームをカバーできます。
等圧タグ付け (TMT および iTRAQ)
タンデム マス タグ (TMT ) と相対定量および絶対定量のためのアイソバリックタグ (iTRAQ ) 異なるサンプルからのペプチドを同一質量のタグで標識します。 MS/MS 中に、レポーター イオンが放出されて定量されます。これらの方法は多重化を可能にし、高いスループットを提供しますが、イオンの共分離による比率の歪みが発生する可能性があります。 共同隔離 これは、複数のペプチドが断片化のために一緒に選択されるときに発生し、混合レポーター イオン シグナルが発生します。この混合によって真の信号が汚染され、サンプル間の測定された存在比が歪められます。
ラベルフリーの方法では、化学ラベルを使用せずに、MS データから直接ペプチドまたはタンパク質の存在量を測定します。 2 つの主なアプローチは、スペクトル カウンティングと MS1 です。 スペクトル カウンティング 各タンパク質に割り当てられた MS/MS スペクトルの数を数えることにより、タンパク質の存在量を推定します。シンプルで拡張性がありますが、低濃度タンパク質と狭いダイナミック レンジの精度には限界があります。 ダイナミック レンジ サンプル中のタンパク質存在量の最小値と最大値の間の範囲を指します。 MS1 強度に基づく定量化 スキャン内のクロマトグラフィーのピークからペプチドイオンシグナル強度を測定します。この方法はスペクトル計数よりも高い精度を提供し、複雑なサンプルでもうまく機能します。ただし、サンプルを正確に比較するには、一貫したクロマトグラフィーと慎重な保持時間の調整が必要です。 保持時間 機器がペプチドを検出して測定するまでに、ペプチドがクロマトグラフィー カラムを通過するのにかかる時間です。
TMT はペプチドを標識する方法の 1 つであり、科学者は複数のサンプルを同時に比較できます。 特殊な最新技術 プロテオミクス
単一細胞プロテオミクス 個々の細胞のタンパク質発現を分析し、バルク分析では隠蔽されがちな不均一性を明らかにします。超高感度 MS テクノロジーとサンプル前処理方法を使用して、最小限の入力から少量のタンパク質を検出します。この技術は、細胞特異的なシグナル伝達とタンパク質の発現パターンをプロファイリングすることにより、がん研究、発生生物学、免疫学で使用されます。
リン酸プロテオミクス 細胞シグナル伝達と機能の重要な調節因子であるリン酸化タンパク質の同定と定量に焦点を当てています。 固定化金属アフィニティークロマトグラフィーなどの濃縮方法 (IMAC )、MS 分析の前にリンペプチドを単離します。この方法は、疾患に関与するキナーゼ活性、シグナル伝達経路、および制御ネットワークを明らかにするのに役立ちます。
グリコプロテオミクス 細胞コミュニケーション、免疫、タンパク質の安定性に重要なグリコシル化タンパク質を標的とします。エンリッチメント戦略と MS を使用してグリコシル化部位と構造を分析することにより、糖プロテオミクス分析により、がん、炎症、先天性疾患に関連する変化が明らかになります。
ネイティブ質量分析 (ネイティブ MS ) 非共有結合相互作用を保存しながら、変性せずに無傷のタンパク質複合体を分析します。化学量論、構造力学、タンパク質間相互作用に関する情報を提供します。ネイティブ MS は、クライオ EM や NMR などの構造生物学手法を補完し、生理学的条件に近い状態でのタンパク質構造に関する洞察を提供します。 極低温電子顕微鏡 (クライオ EM ) ネイティブな状態で凍結されたタンパク質の高解像度の 3D 構造をキャプチャします。同時に、ネイティブ MS は質量と結合相互作用を明らかにし、クライオ EM は全体の形状を示し、NMR は原子レベルのダイナミクスを検出します。これらの技術を組み合わせることで、研究者は生物学的に関連する条件におけるタンパク質の挙動をより完全に把握できます。生理学的に近い条件下での発見は、疾患を導く医薬品の開発中にタンパク質の構造や相互作用がどのように変化するかをモデル化するのに役立つ可能性があります。
結論
プロテオミクス技術は、生物学の理解を進めるだけでなく、ヘルスケアやその他の分野におけるイノベーションを推進するためにも不可欠です。これらの方法は、タンパク質の正確かつ大規模な分析を可能にすることで、薬剤の早期検出、個別化された治療戦略、より効果的な薬剤開発をサポートします。その影響は、農業、環境モニタリング、バイオテクノロジーなどの他の産業にも及びます。技術が進化し続けるにつれて、プロテオミクスは、システム生物学、臨床診断、合成生物学や精密栄養学などの新興分野においてさらに大きな役割を果たすことになります。
