紫外光 (UV) の吸光度を測定して、RNA サンプルを定量します。ナノドロップ分光光度計は、回収可能なサンプルを 1 ～ 2 マイクロリットルしか使用しません。他の分光光度計は、はるかに大きなサンプルを必要とします。 UV 波長 260 nm でのヌクレオチドの吸光係数は、光路 1 cm で 20 です。この吸光係数に基づいて、40 μg/ml RNA の同じ条件下での吸光度は 1 です。この情報を使用して、RNA サンプルの濃度を計算できます。
<オール>必要に応じて、サンプルを希釈してください。マイクロキュベットの標準希釈は 1:40 です。 2µL RNA サンプルを 78µL 滅菌水に加えて、この希釈を行います。
特定の分光光度計のプロトコルに従って、ブランクを使用して機械を較正し、UV 波長 260 nm でサンプルの光学密度を決定します。
サンプルの吸光度に希釈倍率を 40μg RNA/mL で掛けます。方程式は次のようになります:「RNA 濃度 (µg/ml) =(OD260) x (希釈係数) x (40µg RNA/ml)/(1 OD260 単位)」 (Hofstra.edu) 例:1:40 で吸光度が 0.08 だった場合、0.08 x 40 x 40 =128 µg/ml =0.13 µg/μL を掛けます
280nm の UV 波長で別の吸光度を読み取って、サンプルの純度を把握します。 OD 260 / OD 280 の比率は、サンプルがタンパク質またはフェノールで汚染されているかどうか、またどのレベルで汚染されているかを示します。 1.8 から 2.0 の結果は高品質の RNA を示します。
必要なもの
- 分光光度計
- 電卓
ヒント
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分光光度計を校正することを忘れないでください。迅速な電気泳動ゲルを実行すると、仕様の結果が確認されます。
警告
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サンプルが純粋であると仮定しないでください。 OD260/OD280 比率に時間をかけることで、時間とお金を節約できます。
